向勤
- 作品数：5 被引量：2H指数：1
- 供职机构：湖南大学生物学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生交通运输工程建筑科学更多>>
- 人FOXA1蛋白的原核表达、纯化及蛋白互作分析
- 2016年
- 构建FOXA1的原核表达载体,诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段,为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA,逆转录成cDNA,设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段,分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21Rosetta DE3,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育,进行GST-Pull down试验,检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX-4T-1-FOXA1-C和pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表达载体;在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C与N端蛋白片段GSTFOXA1-N;证实GST-FOXA1-C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.
- 谭拥军陈竹林陈团辉向勤
- 关键词：原核表达相互作用蛋白
- Bst DNA聚合酶的纯化及等温扩增检测体系的构建被引量：1
- 2019年
- Bst DNA聚合酶是等温扩增反应中的一个关键酶,但由于专利限制,目前国内实验室所使用的Bst DNA聚合酶大多需要从国外进口,价格昂贵且长途运输影响酶活性,因此亟需自主生产出Bst DNA聚合酶应用于等温扩增检测技术.通过构建Bst Fragement的原核表达质粒,采用原核蛋白表达系统和His-Tag亲和纯化手段,制备成本低,活性高,特异性强的Bst DNA聚合酶.同时,针对特定的模板,对自制Bst DNA聚合酶的扩增反应进行了进一步优化,用不同的产物鉴定方法对扩增效果进行检测,并最终筛选出该酶最优的扩增反应条件为60 mM K^+、30 mM(NH4)2SO4、pH为9.0.最后,验证了Bst DNA聚合酶能用于快速准确检测肺炎支原体、肺炎衣原体,降低了相关病原体核酸检测的成本,为之后核酸检测在基层医疗的更广泛应用提供了条件.
- 谭拥军吴莎莎谭桂湘向勤
- 关键词：重组蛋白扩增核酸检测
- 慢病毒介导MCF-7细胞中FOXP2基因沉默体系的建立
- 2018年
- 为了实现FOXP2基因在MCF-7细胞中稳定低表达,采用基因工程的方法构建pMAGic7.1-shFOXP2慢病毒干扰载体,并将其与辅助质粒共转染HEK293T细胞,包装shFOXP2干扰慢病毒,收取病毒上清加入到MCF-7细胞中,培养48h,荧光定量PCR检测FOXP2的基因mRNA表达水平,Western Blotting检测FOXP2蛋白表达水平.获得了pMAGic7.1-shFOXP2干扰载体,从而成功建立FOXP2基因稳定干扰的MCF-7细胞株,为进一步研究FOXP2在乳腺癌发生发展中的功能提供了研究材料.
- 谭拥军郭明月向勤李谕
- 关键词：慢病毒载体RNA干扰乳腺癌MCF-7细胞
- R9-FOXM1(1-234aa)重组蛋白批量纯化及其抑瘤效应研究被引量：1
- 2017年
- 通过基因工程构建重组表达质粒pET15b-R9-FOXM1(1-234aa),转化大肠杆菌建立构建表达R9-FOXM1(1-234aa)的菌株.采用原核表达系统和His-tag亲和纯化手段,规模化制备纯化穿膜肽R9-FOXM1(1-234aa),获得的蛋白的纯度达到90%以上.用R9-FOXM1(1-234aa)穿膜肽处理不同的肿瘤细胞,通过MTT实验研究其细胞效应.结果显示:当R9-FOXM1(1-234aa)穿膜肽的浓度达到2mM时,肿瘤细胞的死亡率为50%左右.实验表明穿膜肽R9-FOXM1(1-234aa)抑制不同肿瘤细胞的生长,有可能成为治疗肿瘤的潜在蛋白类药物.
- 谭拥军余景卫陈燕向勤谭桂湘
- 关键词：FOXM1肿瘤治疗
- 基于FOXM1启动子示踪体系对MDA-MB-231细胞亚群的分选与鉴定
- 2020年
- 为实现细胞内FOXM1表达的可视化,采用基因工程的方法构建慢病毒载体(Lv-Promoter FOXM1-GFP)。该慢病毒载体携带1.2 kb的FOXM1启动子区域和绿色荧光蛋白(GFP)基因。将Lv-Promoter FOXM1-GFP与辅助质粒共转染HEK293T细胞,包装慢病毒并感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞。以未感染病毒的MDA-MB-231细胞样品作为阴性对照,经流式细胞仪分析,发现实验组GFP阳性细胞数升高,证明慢病毒感染成功。以GFP的表达为标准,将Lv-Promoter FOXM1-GFP感染的MDA-MB-231细胞通过流式分选,获得GFP-High细胞亚群和GFP-Low细胞亚群。通过Western Blot证实根据GFP所分选出的两组细胞亚群的FOXM1表达量有显著差别,且GFP水平可以对应细胞内的内源FOXM1表达水平。因此在癌细胞中以FOXM1表达水平的高低分离出癌细胞亚群,为研究FOXM1在乳腺癌发生发展中的功能提供了研究材料,也对进一步研究FOXM1的生物学特性以及靶向肿瘤诊断与治疗具有十分重要的意义。
- 汪运超李子青向勤谭拥军
- 关键词：慢病毒载体FOXM1乳腺癌细胞MDA-MB-231
