王健
- 作品数：1 被引量：1H指数：1
- 供职机构：辽宁医学院附属第一医院更多>>
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- pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体的构建和鉴定被引量：1
- 2014年
- 目的构建pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为研究TFPI-2基因的功能做准备。方法从胎盘组织中提取总RNA,逆转录合成cDNA,再以PCR法进行扩增。将扩增的TFPI-2基因片段克隆到pEGFP-N3真核表达载体上,经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后,行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,同时测定其DNA序列。将pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体以脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法转染Top10感受态细胞(转染组),同时设空白对照组(仅转染pEGFP-N3质粒)和未转染组(不予转染)。采用Western blot法检测3组细胞中TFPI-2蛋白的表达情况。结果总RNA经分光光度法验证,其纯度符合PCR法扩增的要求。构建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后,行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,分别在708 bp处和4 700 bp处有特异扩增条带,大小与理论值一致。DNA序列测定结果证实,pEFFP-N3-TFPI-2真核表达载体的序列完全正确。Western blot法结果显示,TFPI-2蛋白的表达量转染组为0.657 3±0.032 5,空白对照组为0.301 7±0.028 7,未转染组为0.314 3±0.026 6,转染组TFPI-2蛋白的表达量高于空白对照组和未转染组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论本实验成功构建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为TFPI-2基因功能的研究奠定了基础。
- 王健王晓东唐冠杰赵佳
- 关键词：组织因子途径抑制物-2WESTERNBLOT法
