车路平
- 作品数：5 被引量：14H指数：2
- 供职机构：中国农业科学院上海兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 鸡TIGAR基因真核表达质粒的构建及其抗凋亡功能评价被引量：1
- 2019年
- 【背景】TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和去除活性氧(Reactive oxygen species,ROS)并降低由活性氧诱发的细胞凋亡水平。【目的】构建鸡源TIGAR基因的真核表达质粒,并检测TIGAR基因在DF1细胞中的抗凋亡作用,为建立稳定表达鸡TIGAR基因的细胞系做准备。【方法】根据GenBank(登录号:XM_417232.6)中预测基因设计引物,利用RT-PCR的方法从SPF鸡脾脏中扩增鸡TIGAR基因,将扩增产物克隆至载体(Flag-CMV14)后送公司测序验证;随后构建进化树对鸡TIGAR基因与其他哺乳动物及水生动物的TIGAR基因进行同源性分析。将重组质粒(Flag-TIGAR)转染入DF1细胞24 h后,使用新城疫病毒诱导细胞凋亡,利用Western Blot检测重组质粒表达情况以及Poly ADP-Ribose Polymerase(PARP)裂解情况。此外还将重组质粒(Flag-TIGAR)转染入DF1细胞,并于收样前2 h使用Staurosporine刺激细胞发生凋亡,分别在转染后24、48 h收集样品,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】RT-PCR扩增TIGAR基因,在843 bp处出现目的条带与预测相符,构建的TIGAR真核表达质粒(Flag-TIGAR)经测序,结果显示其序列与GenBank上预测的基本一致。Western Blot结果显示在30 h、36 h收集的样品中PARP均被裂解且转染重组质粒(Flag-TIGAR)的实验组与未转染质粒(MOCK)组或转染空载体(Flag-CMV14)组的样品相比,裂解的PARP表达量明显降低,且差异极显著(P<0.01)。流式结果显示:24 h检测转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为11%(早期凋亡7.8%,晚期凋亡3.2%),而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率仅为4%(早期凋亡3.7%,晚期凋亡0.3%),转染Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR组,且差异显著(P<0.05)。48 h转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为20.3%(早期凋亡14.3%,晚期凋亡6.0%),而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率为6.4%(早期凋亡4.8%,晚
- 栗永华车路平仇旭升谭磊孙英杰刘炜炜宋翠萍廖瑛丁铲王金泉孟春春
- 关键词：真核表达质粒新城疫病毒抗凋亡
- 新城疫病毒溶瘤株SH15全基因组序列的测定及分析
- 2017年
- 以上海某鸡场分离的1株对LoVo细胞及A549细胞具有良好的溶瘤效果且呈时间依赖性的新城疫病毒(Newcastle diseases virus,命名为SH15)为研究对象,依据Gen Bank中Mukteswar毒株,设计了10对引物以用于扩增SH15的片段cDNA,并对阳性克隆进行菌液PCR鉴定以及测序分析。测序分析比对结果确定,SH15株的全基因组长15 186 bp,在GenBank登录号为KY247177,结合生物学试验确定为中等毒力型。与其他毒株序列分析表明:该毒株与JS/9/05/Go、Mukteswar的全基因组同源性为99.8%,属于NDV的ClassⅡ分支中的基因Ⅲ型。推测SH15的溶瘤能力可能与HN蛋白中H203位点变异有关。本研究为了解新发现的溶瘤NDV毒株的生物学特性及全基因序列,以及以NDV为载体进一步开发肿瘤靶向药物奠定了基础。
- 段坦然孟春春车路平廖瑛仇旭升谭磊孙英杰宋翠萍丁铲唐兆新
- 关键词：新城疫病毒溶瘤HN蛋白
- 基于萤火虫荧光素酶报告基因检测凋亡的系统构建及鉴定被引量：1
- 2019年
- 为构建一个能够快速检测凋亡的含荧光素酶报告基因(Fluc)的真核表达质粒,采用PCR的方法将Caspase-3的识别基序Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)四个氨基酸引入至Fluc基因的C端和N端之间;同时选取Asp-Glu-Val-Gly (DEVG)四个氨基酸作为阴性对照。随后重组片段分别克隆至分离型内含肽的N端和C端之间,并命名为pFluc-DEVD和pFluc-DEVG。将该表达质粒与海肾荧光素酶报告质粒(RLUC)同时转染至HeLa细胞,通过双荧光素酶报告基因和Western blotting实验检测细胞凋亡水平。双荧光素酶报告基因系统实验结果显示,当发生凋亡时,pFluc-DEVD质粒组表达的萤火虫荧光素酶的含量高出pFluc-DEVG质粒组约3倍。Western blotting检测结果显示,转染pFluc-DEVD质粒的细胞在凋亡药物刺激后,Fluc活化的蛋白显著增多,且Caspase-3 的活化程度与Fluc的表达呈正相关,并有显著的统计学差异。以上结果表明,pFluc-DEVD真核表达质粒表达的萤火虫荧光素酶蛋白能被细胞内的Caspase-3酶裂解,且该质粒能够精确地反映出细胞的凋亡水平,为后续进行凋亡定量检测提供了一个可借鉴的方法。
- 车路平车路平杨斌徐智凯廖瑛廖瑛仇旭升谭磊孙英杰宋翠萍丁铲姚刚王金泉
- 关键词：萤火虫荧光素酶凋亡CASPASE-3
- 基于中国知网数据的鸡传染性支气管炎病毒混合感染分析被引量：11
- 2018年
- 以中国知网作为数据统计源,检索鸡传染性支气管病毒混合感染案例,对混感临床案例的地区分布、发病鸡品种和鸡传染性支气管炎病毒混合感染疾病类型进行分析。结果表明,鸡传染性支气管病毒混合感染的地区分布与我国家禽存栏量的地区分布现状相符;肉鸡发生鸡传染性支气管病毒混合感染的比例远高于蛋鸡;细菌和病毒是鸡传染性支气管病毒混合感染的主要病原,支原体和寄生虫在混合感染中的占比很少;在细菌的混合感染中,大肠杆菌占绝对数量优势;在病毒中主要是新城疫病毒,其次是禽流感病毒,此外鸡传染性支气管病毒与新城疫病毒和禽流感病毒易发生三重感染。本文归纳了近10年我国鸡传染性支气管病毒混合感染的基本特征,为认清鸡传染性支气管防控存在的问题及提高疫病防控水平提供了有力参考。
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- 关键词：鸡传染性支气管炎
- 鸡传染性支气管炎病毒分离株CK/CH/HD/171018的生物学特性及其全基因组序列分析被引量：2
- 2018年
- 为了明确传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)分离株CK/CH/HD/171018的生物学特性,本研究对所分离IBV CK/CH/HD/171018株首先进行了HA检查阴性、侏儒胚阳性检查及致病性试验;随后设计了23对引物进行全基因组内部序列扩增及使用cDNA末端快速克隆技术获得3'和5'的精准序列,并与不同基因型的参考毒株全基因组进行同源性比对、构建遗传进化树进行基因分型及重组分析。结果显示:该毒株自然状态下无血凝性,接种SPF鸡胚可导致鸡胚发育迟缓并产生典型的侏儒胚现象,对3日龄SPF雏鸡的致死率为100%;CK/CH/HD/171018基因组全长为27 688 bp,结构为5'Cap-Replicase-S-3a-3b-3c/E-M-5a-5b-N-poly(A)3',其中3'有14个A;CK/CH/HD/171018属于QX基因型,该分离株在Gene1的2个位置有QX型野毒株和CK/CH/LSC/99I型野毒株的重组痕迹,属于QX强毒型IBV。本研究丰富了IBV的生物信息数据库,为进一步从分子水平研究IBV的流行情况、变异机制及致病特征等奠定了基础。
- 李智超王友令徐腾飞栗永华车路平车路平仇旭升仇旭升孙英杰谭磊廖瑛宋翠萍丁铲姚刚孟春春
- 关键词：鸡传染性支气管炎病毒生物学特性
