徐锦凤
- 作品数：9 被引量：33H指数：4
- 供职机构：石河子大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 绵羊NYD-SP27基因在BHK-21细胞中的稳定表达及其特征鉴定
- 2017年
- 旨在构建稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞株,对NYD-SP27基因的表达特征进行分析,为进一步研究NYD-SP27基因功能奠定基础。本研究克隆绵羊NYD-SP27基因,并将其插入到真核表达载体pDsRed1-C1中,利用猪捷申病毒2A肽(P2A)将NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白连接以实现共表达,将重组质粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP转染至BHK-21细胞中,经G418筛选获得稳定转基因细胞株,利用RT-PCR、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blot对NYD-SP27基因的表达进行鉴定。结果表明,NYD-SP27基因稳定整合至宿主细胞基因组;NYD-SP27蛋白能够在BHK-21细胞中正常表达,分子大小约为63ku;在NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白翻译过程中,P2A成功自我剪切。本研究成功构建了绵羊NYD-SP27基因的真核表达载体,建立了稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞系。
- 马亚茹胡广东王红红加米拉徐锦凤陈创夫赛务加甫
- 关键词：BHK-21细胞
- 新疆某地区鸡白痢沙门氏菌病原的分离鉴定及耐药性分析
- ＜正＞研究目的鸡白痢沙门氏菌病是由沙门氏菌属中一个或多个成员引起的禽类传染病,给养禽业和人类的健康生活造成了严重的危害。近几年新疆某些地区频繁发生鸡白痢沙门氏菌病,因此,了解新疆地区该病的主要流行特点及耐药情况,具有重要...
- 刘志科徐锦凤徐明国吴文星姬祥陆亚冬童志霞陈创夫
- 绵羊NYD-SP27基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定被引量：1
- 2018年
- 构建并筛选针对干扰绵羊NYD-SP27基因的shRNA慢病毒载体。使用RNAi Target Sequence Selector软件设计并合成针对绵羊NYD-SP27基因的4条shRNA表达序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)及1条阴性对照序列(NC),分别将其连接到载体pLentiLox3.7(PLL3.7)中,得到4个shRNA干扰载体NYDSP27-shRNA及1条阴性对照载体NC-shRNA,同时将构建好的干扰载体及辅助质粒瞬时共转染至HEK-293FT细胞中,收集病毒液纯化后感染SP27-21细胞,48h后用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测NYD-SP27相对表达量,将干扰效果最好的载体用于进一步的研究中。结果表明,构建了重组慢病毒干扰载体,并成功包装成干扰慢病毒NYDSP27-shRNA-LV以及用来感染BHK-SP27-21细胞,48h后用实时定量PCR筛选出高效干扰绵羊NYD-SP27的片段NYDSP27-shRNA-1。为进一步研究NYD-SP27基因表达下调对绵羊精子发育的影响奠定了基础。
- 陈云蕾袁力明李娜马亚茹徐锦凤赛务加甫
- 关键词：慢病毒
- 沙门菌LAMP可视化检测方法的建立与应用被引量：6
- 2018年
- 建立沙门菌病原体的一种可目视化环介导等温扩增技术(LAMP),实现对沙门菌的高效快捷检测。针对沙门菌的invA基因的高度保守区域,设计一套特异性引物,优化LAMP扩增反应体系和条件,并对该方法的特异性、灵敏性和人工污染样品以及临床样品分别进行检测。与传统的细菌分离与鉴定、PCR和real-time PCR方法进行敏感性比较。该方法优化后的最佳反应体系为内外引物浓度比例为3∶1,dNTPs为2.5μL,MgSO_4为1.5μL,2.5μL甜菜碱(10mol/L),1μL Bst 2.0DNA聚合酶,在62℃恒温条件下反应50min,可以特异性检出沙门菌,而对其他非沙门菌病原的检测结果为阴性。该方法的最低检测线为1.0×10~2 CFU/mL,灵敏度是常规PCR检测方法的1 000倍,与real-time PCR方法的灵敏度基本接近;针对人工污染沙门菌的鱼粉其检测灵敏度为5.0×10~2 CFU/mL;对临床样品的检出率为65.4%,与传统检测方法的检出率一致。本研究建立的LAMP检测沙门菌的方法特异性强、灵敏度高、操作简便、效能高和可视化,为基层监管部门和畜牧兽医工作者对于沙门菌病原的监控和初步筛选提供了技术保障。
- 刘志科张洁杨宁宁徐锦凤徐明国荆明龙吴文星曹旭东任艳石峰陈创夫
- 关键词：沙门菌环介导等温扩增技术
- 布鲁氏菌GMD重组蛋白表达及对昆明系小鼠的免疫效果研究
- 2017年
- 【目的】对布鲁氏菌GMD蛋白进行生物信息学预测分析和免疫原性研究,并在小鼠模型上评价其免疫效果。【方法】对GMD蛋白进行生物信息学分析,分析预测其结构及功能,采用PCR技术对布鲁氏菌gmd基因进行特异性扩增,与p ET-28a表达载体连接后转化至E.coli BL21(DE3)中,通过SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白的表达及其反应原性,并通过小鼠免疫和攻毒实验评价其免疫原性以及免疫保护力。【结果】生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,有15个抗原决定簇,不存在信号肽,二级结构以α-螺旋为主。并利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。SDS-PAGE分析表明获得了约43.7 ku的融合蛋白,Western Blot结果显示该融合蛋白与羊抗布鲁氏菌阳性血清发生特异性反应。间接ELISA结果显示,免疫小鼠7、14、21 d,实验组小鼠均可产生抗体,且随时间增加抗体水平也随之升高。免疫保护力测定结果显示小鼠脾指数和脾脏CFU均低于PBS组。【结论】GMD重组蛋白具有良好的反应原性,其免疫小鼠后可诱导产生高水平的特异性抗体,具有良好的免疫原性;攻毒后能发挥一定免疫保护作用。
- 徐锦凤王震易德武易继海马旭升姬祥张辉陈创夫
- 关键词：布鲁氏菌免疫原性保护力
- 布鲁菌对不同分化类型巨噬细胞JAK-STAT6信号通路的影响被引量：6
- 2017年
- 为研究布鲁菌侵染巨噬细胞过程中,对后者不同分化类型细胞中JAK-STAT6信号通路和细胞因子表达变化的影响,本研究利用小鼠巨噬细胞系RAW264.7,经40 ng/m L的IL-4体外作用24 h将其诱导为M2型巨噬细胞,采用细胞免疫荧光方法,检测M2巨噬细胞极化状态;通过荧光定量PCR(q RT-PCR)方法,检测布鲁菌疫苗株M5侵染不同类型(M0和M2型)巨噬细胞中JAK1、STAT6基因mRNA转录情况;采用ELISA方法检测M5侵染不同类型巨噬细胞上清中IL-10、INF-γ的表达情况。细胞免疫荧光检测结果显示,IL-4诱导24 h后,巨噬细胞表面标志CD206荧光表达量超过90%,表明巨噬细胞极化为M2型;q RT-PCR结果显示,M5侵染M0型巨噬细胞后能够引起JAK1、STAT6 mRNA转录水平持续降低,在24 h和48 h时其转录水平最低,二者差异极显著(p<0.01);而M5侵染M2型巨噬细胞后,与未极化组(M0型)相比,JAK1、STAT6的mRNA转录水平增高,同时存在时间差异性,侵染8 h时,二者mRNA转录水平最高,差异极显著(p<0.01)。ELISA结果显示,M5侵染巨噬细胞后,极化组(M2型)与未极化组(M0型)巨噬细胞相比,INF-γ的表达量差异不显著(p>0.05),而IL-10的表达量上调且在侵染48 h达到最大值,差异显著(p<0.05)。上述结果表明,在IL-4的诱导下巨噬细胞可以从未极化的M0型极化为M2型;布鲁菌M5侵染M0型巨噬细胞中JAK1、STAT6的转录水平下调,但上调M2型巨噬细胞JAK1、STAT6的转录水平并促进下游细胞因子IL-10的分泌。本研究为探究布鲁菌引起持续感染的机制研究奠定了基础,同时为布鲁菌病药物靶标开拓了新的研究方向。
- 王月丽易继海王震唐燕童志霞徐锦凤张辉陈创夫
- 关键词：布鲁菌
- 鸡白痢沙门氏菌invA基因的克隆与原核表达被引量：1
- 2018年
- 【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因并进行原核表达,分析重组蛋白invA的抗原性,为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌,克隆其invA基因,对invA基因编码的蛋白进行生物信息学分析。将invA基因克隆到pET-30a原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a-invA,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,检测其目的蛋白的表达情况和免疫反应特性。【结果】成功获得了1 143bp的完整的invA基因,编码381个氨基酸。生物信息学分析结果表明,invA基因编码的蛋白有17个抗原决定簇,其跨膜区域明显,92-105位氨基酸为low complexity典型结构域。构建获得了原核重组表达质粒pET-30a-invA,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了约51ku的invA融合蛋白;Western-blot检测结果显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应性。【结论】成功克隆出了1 143bp大小invA基因,明确了其编码蛋白的生物信息,其诱导表达后获得免疫反应性良好的重组蛋白。
- 刘志科张秋雨杨宁宁徐锦凤徐明国荆明龙吴文星曹旭东任艳石峰陈创夫
- 关键词：鸡白痢沙门氏菌原核表达生物信息学分析免疫反应性
- 鸡白痢沙门氏菌病原的分离鉴定及耐药性分析被引量：12
- 2017年
- 为鉴定新疆某些地区鸡白痢沙门氏菌主要流行株的流行现状和耐药情况,本研究采用平板凝集试验方法对有发病史的种鸡场进行现场检测,被检的750只鸡中,发现78例疑似鸡白痢沙门氏菌感染,运用沙门氏菌鉴别培养基、组织病理学观察和PCR方法进行确诊,并进行药敏试验。结果显示,疑似的78例鸡白痢沙门氏菌中有69例符合鸡白痢沙门氏菌的生化特性和病理学特点,PCR成功扩增出invA基因,分离率为9.2%,血清型诊断为D1型;其中分离菌对万古霉素和新霉素耐药性最高,耐药率分别为100.0%和81.2%,而对头孢曲松、克拉维酸和多黏菌素的敏感率达60.0%以上。本研究为养殖户和兽医工作者在净化鸡白痢沙门氏菌及临床用药方面提供参考。
- 刘志科杨宁宁徐锦凤徐明国荆明龙吴文星曹旭东任艳石峰陈创夫
- 关键词：鸡白痢沙门氏菌组织病理学PCR药敏试验
