宋姗姗
- 作品数：3 被引量：4H指数：1
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- 稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系的建立被引量：3
- 2015年
- 为建立稳定表达施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳(N)蛋白的BHK-21细胞系,本研究在SBV-N蛋白编码基因的C端加入6个组氨酸(6×His)标签,将其克隆至慢病毒载体p LV-EGFP-C中构建重组慢病毒质粒p LV-EGFP-SBV-N,将其与慢病毒包装质粒p Helper1.0和p Helper2.0共转染HEK-293T细胞,包装表达SBV-N蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染BHK-21细胞,采用嘌呤霉素(Puromycin)法和细胞有限稀释法筛选出一株稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系,命名为BHK-21-EGFP-SBV-N。间接免疫荧光试验进一步表明,该细胞系能够被SBV抗体阳性动物血清和特异性单克隆抗体2C8识别。稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系的建立,为SBV血清学检测方法的建立提供材料。
- 张永宁吴绍强宋姗姗董宣林祥梅
- 关键词：施马伦贝格病毒核衣壳蛋白慢病毒载体
- 施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的表达及单克隆抗体制备被引量：1
- 2016年
- 为表达与纯化具有天然构象的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)核衣壳(N)蛋白,并制备其单抗(McAb),本研究在SBV-N基因的N端加入6个组氨酸(6×His)标签后,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac^(TM)1中,构建重组供体质粒pFastBac-His-SBV-N。将pFastBac-His-SBV-N转化DH10Bac E.coli,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-His-SBV-N。将rBacmid-His-SBV-N转染Sf9昆虫细胞制备表达His-SBV-N融合蛋白的重组杆状病毒,借助Ni-NTA琼脂糖纯化重组杆状病毒感染Sf9细胞中的His-SBV-N蛋白。以纯化的HisSBV-N免疫BALB/c小鼠制备McAb,利用ELISA叠加试验检测McAb抗原识别位点的异同,并采用高碘酸钠法对识别不同抗原表位的McAb进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。最终获得了4株识别不同抗原表位的McAb(2A11、2E1、4H11和6E12)并进行了HRP标记;亚型鉴定表明,2A11为IgG1亚型,2E1、4H11和6E12均为IgG2b亚型;间接免疫荧光试验证实,4株McAb均能够识别稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系;Western blot进一步表明,HRP标记的4株McAb均与His-SBV-N蛋白发生特异性反应。His-SBV-N融合蛋白及其McAb的成功制备,为施马伦贝格病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。
- 张永宁宋姗姗吴绍强林祥梅
- 关键词：施马伦贝格病毒核衣壳蛋白昆虫细胞单克隆抗体
- 施马伦贝格病毒核衣壳蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与纯化
- 2016年
- 为表达与纯化具有天然构象的施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳(N)蛋白,在SBV-N蛋白编码基因的N端引入谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签编码序列,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac 1中构建重组供体质粒pFastBac-GST-SBV-N;经测序鉴定后,将pFastBac-GST-SBV-N转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使其与DH10Bac内含有的杆状病毒穿梭载体(杆粒)进行位点特异性转座,形成重组杆粒Bacmid-GST-SBV-N;抽提重组杆粒,转染Sf9昆虫细胞制备表达GST-SBV-N融合蛋白的重组杆状病毒rBac-GST-SBV-N;利用间接免疫荧光试验检测rBac-GST-SBV-N感染的Sf9细胞与SBV抗血清的反应情况。结果表明,rBac-GST-SBV-N感染的Sf9细胞能够与SBV抗血清发生特异性反应。利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B纯化Sf9细胞内表达的GST-SBV-N融合蛋白,借助Pre Scission蛋白酶切除GST标签后,对重组SBV-N蛋白进行Western-blot鉴定和间接ELISA分析。结果显示,在分子质量约为26 ku处出现一条特异性条带,其大小与SBV-N蛋白相符;该蛋白与抗SBV-N蛋白单克隆抗体2C8和SBV抗血清均能发生特异性反应,说明该蛋白具有良好的反应原性。SBV-N真核表达蛋白的成功制备和纯化,为施马伦贝格病血清学检测方法的建立提供了诊断抗原。
- 宋姗姗张永宁吴绍强林祥梅
- 关键词：施马伦贝格病毒核衣壳蛋白昆虫细胞蛋白纯化
