背景:血管内皮发生的分子机制是细胞及基因替代治疗的首要前提。目的:构建一种通过血管内皮细胞特异蛋白TIE2启动子来启动表达的E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)融合的真核表达质粒。方法:根据GenBank中公布的TIE2基因的启动子序列,人工合成TIE2启动子DNA序列,经AseⅠ和NheⅠ双酶切后,亚克隆入表达质粒pEGFP-N1中构建pTIE2-EGFP-N1。同时,用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pcDNA3.1myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入质粒pTIE2-EGFP-N1中构建pTIE2-CREG-EGFP-N1,酶切鉴定。应用脂质体法将该质粒转染至体外培养的小鼠动脉内皮细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。结果与结论:经酶切鉴定证实实验构建的pTIE2-CREG-EGFP-N1质粒正确;体外转染48h,荧光显微镜下可见EGFP的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。说明实验成功构建了pTIE2-CREG-EGFP-N1重组质粒,其可携带目的基因在小鼠动脉内皮细胞中有效表达。
