张建华
- 作品数：1 被引量：2H指数：1
- 供职机构：郑州轻工业学院食品与生物工程学院更多>>
- 发文基金：郑州市科技攻关计划项目河南省科技攻关计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：轻工技术与工程更多>>
- 嗜热细菌莱廷格热袍菌TMO普鲁兰酶TMP在大肠杆菌中的原核表达与酶学性质被引量：2
- 2016年
- 利用PCR技术从嗜热细菌莱廷格热袍菌TMO中扩增得到普鲁兰酶TMP的基因(Tlet_1262),将该基因克隆至表达载体p ET15b,并经IPTG诱导在大肠杆菌BL21-Coden Plus(DE3)-RIL中实现可溶性表达。通过80℃热处理和镍柱亲和层析两步纯化,得到纯化重组酶。SDS-PAGE分析表明:该酶分子质量为97.0 ku。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度90℃,最适p H 5.4。在最适反应温度90℃处理150 min,酶活力稳定在80%以上。普鲁兰酶TMP具有较强的耐酸性,在90℃高温和p H 5.0的酸性条件处理20 h,仍保持50%以上的活性。该酶对金属离子和变性剂SDS、尿素、Tween80和Trtion-X100具有一定抗性。还原剂DTT(0.5,5 mmol/L)对该酶活性具有明显激活作用,分别提高酶活18%和28%。在此基础上,利用重叠PCR构建普鲁兰酶TMP点突变体C501S、C649S和C704S。通过动力学分析,点突变体C649S催化普鲁兰糖和可溶性淀粉底物的效率(kcat/Km)相对于野生型分别提高37.8%和40.8%。由此推测C649位点可能与普鲁兰酶TMP催化功能密切相关。
- 魏涛迟雷余轩张建华刘坤毛多斌
- 关键词：普鲁兰酶克隆表达酶学性质
