刘凤娟
- 作品数：7 被引量：8H指数：2
- 供职机构：西北农林科技大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：中国博士后科学基金中央高校基本科研业务费专项资金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因LsCAS的原核表达及蛋白聚合状态分析
- 2021年
- 该研究从山黧豆种子萌发6 d后的幼苗根中扩增到β-腈基丙氨酸合成酶基因(LsCAS)的CDS序列,并构建pGEX2T-LsCAS表达载体;经诱导表达后,通过GST亲和层析进行LsCAS蛋白纯化,并利用GST标签抗体和大豆半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase,CS)抗体对纯化蛋白进行Western-blot验证;纯化后的LsCAS蛋白经凝血酶切除GST标签抗体后,利用凝胶过滤预装柱Superdex 200 Increase 10/300 GL分析判断分子量。结果显示:(1)山黧豆LsCAS基因的CDS序列为1035 bp,编码344个氨基酸;其编码的蛋白质具有典型的CBS-like蛋白功能结构域胱硫醚β-合酶(CBS)和半胱氨酸合成酶(CS)。(2)成功构建LsCAS基因的原核表达载体pGEX2T-LsCAS并进行蛋白纯化;SDS-PAGE检测表明,所获融合蛋白条带单一,大小在64 kD左右;Western-blot分析发现,诱导后的菌体蛋白和纯化后的重组蛋白中均能检测到特征条带,说明所获融合蛋白为山黧豆LsCAS蛋白。(3)纯化的山黧豆LsCAS蛋白在412 nm的特征吸收峰显示,LsCAS隶属于磷酸吡哆醛(PLP)依赖的半胱氨酸合成酶家族;分子排阻试验证实山黧豆LsCAS为PLP依赖性蛋白酶,可能以四聚体方式发挥作用。研究结果为进一步探讨山黧豆LsCAS的调控及其功能奠定了基础。
- 贾海燕李辰浩宋瑶瑶刘凤娟焦成瑾徐全乐
- 关键词：山黧豆原核表达蛋白纯化
- 大岩桐SsKN1基因的克隆及组织表达分析
- 2018年
- 以大岩桐(Sinningia specisoa)茎尖组织为试材,采用RT-PCR方法对大岩桐SsKN1(KNOTTED1-like homeobox)基因进行克隆,经BLAST比对、邻接法构建进化树,研究了SsKN1基因与其它KNOXI基因的亲缘关系;并利用半定量RT-PCR,研究了SsKN1基因在大岩桐根、花瓣、花萼、叶、茎和茎尖等不同组织中的表达情况,以期为SsKN1基因的功能研究奠定基础。结果表明:获得了大岩桐SsKN1基因451bp的cDNA序列,该基因与烟草NTH15基因亲缘关系最近,其次为拟南芥STM基因;SsKN1基因在根、叶、茎尖和花萼等4种组织中表达,在花瓣和茎中不表达。其中在茎尖的表达量最高,叶中的表达量次之,根和花萼的表达量较低。
- 毕春晓刘凤娟曲瑞红胡鑫徐全乐
- 关键词：大岩桐基因克隆组织表达分析
- 山黧豆β-ODAP生物合成的代谢组学研究
- 山黧可(Lathyrus sativus L.)种植历史悠久、抗逆性极强,是干旱、半干旱地区重要的潜势作物。但内源毒素β-ODAP的存在限制了山黧豆的推广、应用价值。因而,揭示山黧豆发育过程中β-ODAP相关的代谢调控机...
- 刘凤娟毕春晓陶英杰胡鑫徐全乐
- 关键词：山黧豆代谢组学
- 文献传递
- 山黧豆CASase基因的克隆及RNAi载体的构建被引量：6
- 2016年
- β-腈基丙氨酸合成酶(CASase)是调控山黧豆(Lathyrus sativus)内源毒素β-ODAP合成的关键酶。本研究以山黧豆幼根RNA为模板,利用RT-PCR扩增了505bp的山黧豆CASase基因序列;通过Gateway BP反应将扩增片段连接到入门载体构建pENTR-CASase。经测序验证后,将目的片段插入到植物表达载体构建pSGRNAiCASase,并将其转化到农杆菌GV3101中;为进一步的遗传转化奠定了基础。
- 张明科刘凤娟陶英杰胡鑫李荣硕徐全乐
- 关键词：山黧豆GATEWAYRNAI载体构建
- 山黧豆种子萌发特异性蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究被引量：2
- 2018年
- 蛋白酶在种子萌发过程中参与了储藏蛋白水解等多种生理过程,为植物的生长发育提供氮源并在种子萌发的生化机制中有重要作用。本研究采用明胶酶谱法检测了山黧豆种子在不同萌发时间的蛋白酶表达情况。利用盐析、离子交换层析等方法从萌发6d的山黧豆种子中分离纯化了蛋白酶并对其基本酶学性质进行了研究。结果表明,山黧豆种子萌发特异性蛋白酶造成了种子萌发过程中高分子质量蛋白质的水解和较低分子质量蛋白质的积累。对纯化蛋白酶进行总蛋白含量、酶活力、酶比活力等检测表明,山黧豆蛋白酶的纯化倍数为6.58,蛋白得率为7.97%。山黧豆蛋白酶对金属离子的耐受性较高,添加Fe3+可以引起蛋白酶活性的显著增加。此外,该蛋白酶对血红蛋白和明胶的反应活性最高,其最适反应pH和温度分别为pH7和60℃。本研究为进一步研究山黧豆种子萌发过程中蛋白质水解与其内源毒素β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸积累的相互关系奠定了基础。
- 曲瑞红刘凤娟毕春晓宋瑶瑶胡鑫徐全乐
- 关键词：山黧豆萌发种子蛋白酶分离纯化
- 山黧豆CASase基因DNA全长序列的扩增及CRISPR/Cas9敲除载体的构建被引量：3
- 2018年
- 【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因(CASase)DNA全长序列,构建CRISPR/Cas9敲除载体,为筛选"低毒、高硫"山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4d山黧豆幼苗根部为材料,提取其基因组DNA,利用PCR克隆CASase基因全长;经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后,在CASasecDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测;从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA,利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r、pPLHACas9-sgRNA68r、pPLHACas9-sgRNA225f和pPLHACas9-sgRNA256f。【结果】获得了CASase基因3 143bp的DNA全长序列,该序列编码β-腈基丙氨酸合成酶;在CASase cDNA中选取5个sgRNA靶位点在体外均能有效剪切靶序列;菌落PCR检测结果显示,4个CRISPR/Cas9基因敲除载体构建成功。【结论】克隆了山黧豆CASase基因DNA全长,成功构建了该基因上4个sgRNA靶位点的CRISPR/Cas9敲除载体。
- 陶英杰刘凤娟毕春晓任雪冰曲瑞红李科友徐全乐
- 关键词：山黧豆基因克隆
- 大岩桐SsPIN2基因的克隆及组织表达分析被引量：1
- 2016年
- 以大岩桐为试材,采用RT-PCR方法对大岩桐SsPIN2基因进行了克隆,获得898bp的基因序列,经BLAST比对,采用邻接法构建进化树;并利用半定量RT-PCR方法,研究了SsPIN2基因在大岩桐叶、茎尖、根、茎、花瓣和花萼组织的表达情况。结果表明:大岩桐SsPIN2基因与黄瓜CsPIN2、豌豆PsPIN2基因等亲缘关系较近;该基因在上述6种组织中均有表达组织,其中在茎尖、根、茎和花萼的表达量较高,在叶和花瓣中的表达量较低。
- 徐卫平刘凤娟毕春晓胡鑫徐全乐蒋景龙
- 关键词：大岩桐基因克隆
