李慧春
- 作品数：10 被引量：14H指数：2
- 供职机构：中国农业科学院上海兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家生猪现代产业技术体系建设项目国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 猪流行性腹泻病毒Nsp12与宿主RNF7蛋白相互作用的研究
- 2021年
- 猪流行性腹泻病毒(PEDV)编码的Nsp12蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性,在PEDV复制过程中发挥重要作用。为了研究与Nsp12蛋白相互作用的宿主细胞蛋白对PEDV复制的影响,本研究利用酵母双杂交技术将诱饵质粒pGBKT7-Nsp12与猪小肠绒毛上皮细胞(IECs)cDNA酵母表达文库进行杂交筛选,获得的阳性克隆经过测序鉴定证实为环指蛋白7(RNF7),将pGBKT7-Nsp12与p GADT7-RNF7进行酵母回复验证,结果显示二者共转化后能分解SD/-4/X/A中的X-α-Gal形成蓝色菌落,表明Nsp12与RNF7蛋白在酵母中存在相互作用。同时,构建p CAGGS-Nsp12-HA和p CAGGS-Flag-RNF7真核表达载体,利用针对不同标签的抗体进行正向和反向免疫共沉淀鉴定,进一步证实PEDV Nsp12蛋白与RNF7蛋白之间存在直接相互作用;激光共聚焦显微镜观察发现Nsp12蛋白和RNF7蛋白在细胞质中存在共定位现象。为了分析宿主细胞中RNF7蛋白异常表达对PEDV增殖的影响,将构建的RNF7真核表达质粒pcDNA3.1-RNF7转染LLC-PK1细胞后,再用PEDV感染过表达RNF7的LLC-PK1细胞,通过western blot检测LLC-PK1细胞中PEDV N蛋白表达量,荧光定量PCR检测PEDV N基因转录水平,采用TCID50方法检测病毒滴度,结果显示,过表达RNF7后LLCPK1细胞内PEDV N蛋白表达量和N基因拷贝数均下降,其子代病毒滴度也明显低于正常对照组,表明过表达RNF7蛋白可以抑制PEDV的增殖。而利用si RNA-178敲低宿主细胞内源性RNF7蛋白的表达,再以MOI 0.01的PEDV感染后,对感染后不同时间的细胞样品进行western blot检测和病毒滴度检测,结果显示在PEDV感染后24 h,细胞内PEDV N蛋白表达量明显增加,PEDV的滴度在感染后18 h和24 h时分别是对照组的1.10倍和1.17倍。本研究结果首次证实了宿主细胞中RNF7蛋白表达对PEDV的复制发挥负调控作用,为深入探究PEDV复制调控的分子机制奠定了基础。
- 赵雄伟李慧春陈鹏飞周书亭吴瑕劳梦琴童武高飞虞凌雪刘长龙孔宁单同领于海姜一峰童光志童光志
- 关键词：猪流行性腹泻病毒蛋白相互作用
- 猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体及其抗原表位和应用
- 本发明公开了一种由保藏号为CCTCC NO：C2017257的杂交瘤细胞株分泌的猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体。本发明还公开了包含该单克隆抗体的检测猪Delta冠状病毒的试剂盒。本发明还公开了猪Delta冠状病毒N...
- 童光志周艳君李慧春张文超陈鹏飞李先斌虞凌雪姜一峰高飞李丽薇
- 文献传递
- 猪δ-冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定
- 引言猪δ-冠状病毒(Porcine Delta Coronavirus,PDCoV)是能够引起哺乳仔猪的腹泻、呕吐等临床表现的主要病原之一。PDCoV的核衣壳蛋白N蛋白是相对保守且免疫原性较好的蛋白,在PDCoV的诊断上...
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- 猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建被引量：5
- 2019年
- 猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IECs)是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)在宿主体内感染的靶细胞,为了研究PEDV在体内与宿主细胞蛋白之间的互作关系以便于揭示其致病机理,本研究以IECs为研究对象,提取了IECs的总RNA,利用SMART技术经过反转录、扩增和纯化获得双链cDNAs后,将其与pGADT7-Rec和carrier DNA共同转化至酵母Y187菌株,进行选择性培养基(SD/-Leu)筛选以及文库容量及质量的鉴定。结果显示,本研究构建的IECs-cDNA文库其库容量为1.3×10~8 pfu/mL,插入cDNA片段长度为250～2500 bp,文库阳性率达100%。本研究结果表明构建的IECs-cDNA文库具有较好的多态性,为后续研究PEDV与宿主细胞蛋白之间的互作关系提供了有力支持。
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- 关键词：猪流行性腹泻病毒
- 猪流行性腹泻病毒S1基因在昆虫细胞中的表达与鉴定被引量：8
- 2017年
- 本文以猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株FJzz1/2011株的S1蛋白的切割位点设计合成特异性引物,通过RT-PCR扩增获得S1基因,将其克隆至转移载体p Fast Bac HTA中,获得了重组质粒p Fast Bac HTA-S1,将该重组质粒转化E.coli DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒r Bacmid-S1,再将重组穿梭质粒r Bacmid-S1转染Sf9细胞,48 h后即可观察到明显的细胞病变。将收获的r Bac-S1-P1代病毒在Sf9细胞上连续传3代后,收获细胞培养物,分别用间接免疫荧光鉴定(indirect immunofluorescence assay,IFA)、SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,P3代重组病毒r Bac-S1感染的细胞均呈现亮绿色荧光,证实表达产物可以被PEDV阳性血清和抗S1蛋白的单抗特异性识别;SDS-PAGE电泳结果显示在大约120 k Da左右可观察到特异性条带;Western blot结果证实该蛋白可以被抗S1蛋白的特异性单抗识别。综上研究结果,证明利用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中成功表达了PEDV的S1蛋白,为进一步研究PEDV S蛋白的抗原性奠定了基础。
- 杨德强李慧春陈鹏飞王康李先斌张文超虞凌雪姜一峰高飞黄勤峰于海童光志周艳君
- 关键词：猪流行性腹泻病毒S1蛋白杆状病毒SF9细胞
- 猪Delta冠状病毒N蛋白的表达及单克隆抗体的制备
- 猪Delta冠状病毒(Porcine Delta Coronavirus,PDCoV)是一种能够引起仔猪腹泻的新型冠状病毒,2014年该病毒在美国的猪群中爆发并造成普遍流行,给健康养猪带来了严重的威胁.由于PDCoV是近...
- 张文超虞凌雪李慧春陈鹏飞杨德强李先斌刘欢姜一峰杨莘高飞黄勤峰童光志周艳君
- 关键词：N蛋白单克隆抗体
- 猪流行性腹泻病毒S蛋白在杆状病毒中的表达与鉴定
- <正>猪流行性腹泻是一种由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus,PEDV)引起的新生仔猪严重腹泻的高度接触性传染病,近年来我国新流行的PEDV毒株对新生仔猪的发病率和死亡率均较高...
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- 关键词：猪流行性腹泻病毒S蛋白杆状病毒蛋白表达
- 文献传递
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP12蛋白的表达与鉴定被引量：1
- 2018年
- 本研究扩增了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Hu N4株的NSP12基因,将其克隆于pCold-Ⅰ载体中,获得重组质粒pCold-Ⅰ-NSP12,并转化于E.coli/BL21感受态细胞,在16℃条件下用1 mmol/L的IPTG诱导20 h后,用SDS-PAGE电泳检测表达产物,结果显示在大约18 kDa处出现目标蛋白。用PRRSV特异性阳性猪血清对表达蛋白进行Western blot鉴定,结果显示该蛋白可以被PRRSV阳性猪血清识别。将重组NSP12蛋白纯化后,免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。在MARC-145细胞中,对获得的NSP12多抗血清分别进行Western blot和间接免疫荧光检测(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定,结果显示本研究制备的NSP12多抗血清均可与感染的MARC-145细胞的PRRSV Hu N4株以及在MARC-145细胞中特异表达的NSP12蛋白发生免疫反应。PRRSV NSP12蛋白的表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究NSP12在病毒感染过程中的作用奠定了基础。
- 张文超张文超虞凌雪姜一峰高飞李丽薇李丽薇李慧春陈鹏飞杨德强刘欢童光志杜雅楠
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒原核表达多抗
- 猪Delta冠状病毒N蛋白的表达及单克隆抗体的制备
- 猪Delta冠状病毒(Porcine Delta Coronavirus,PDCoV)是一种能够引起仔猪腹泻的新型冠状病毒,2014年该病毒在美国的猪群中爆发并造成普遍流行,给健康养猪带来了严重的威胁。由于PDCoV是近...
- 张文超虞凌雪李慧春陈鹏飞杨德强李先斌刘欢姜一峰杨莘高飞黄勤峰童光志周艳君
- 关键词：N蛋白单克隆抗体
- 猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体及其抗原表位和应用
- 本发明公开了一种由保藏号为CCTCC NO：C2017257的杂交瘤细胞株分泌的猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体。本发明还公开了包含该单克隆抗体的检测猪Delta冠状病毒的试剂盒。本发明还公开了猪Delta冠状病毒N...
- 童光志周艳君李慧春张文超陈鹏飞李先斌虞凌雪姜一峰高飞李丽薇
- 文献传递
