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人工蛋白XXA促进人源肿瘤抑素Tumstatin可溶性表达
2024年
为实现人源肿瘤抑素Tumstatin在大肠杆菌中的可溶性表达,构建了5种不同促溶性融合标签与tumstatin基因融合表达的重组大肠杆菌BL21(DE3),利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导重组菌进行摇瓶发酵,利用SDS-PAGE和Western-Blot分析并筛选出能可溶性表达Tumstatin蛋白的重组菌。构建的重组菌中BL21/pGEX-6p-1-Tum(含谷胱甘肽巯基转移酶标签—GST标签)、BL21/pET28a-MBP-Tum(含麦芽糖结合蛋白标签—MBP标签)、BL21/pET28a-Tum(无标签)都是以包涵体的形式表达融合蛋白Tumstatin,只有重组菌BL21/pET28a-XXA-Tum(含抗冻蛋白的反向蛋白—XXA标签)能以可溶性的形式表达融合蛋白且目的蛋白占菌体总蛋白45%以上。利用亲和层析对目的蛋白进行纯化并进行Western-Blot分析,得到分子质量为50.9 kDa的目的条带,与理论分子质量一致。进一步对重组菌BL21/pET28a-XXA-Tum的诱导剂添加浓度、诱导剂添加时间、诱导温度、诱导时间诱导条件进行优化。最终选择Tumstatin融合蛋白诱导条件为:诱导剂浓度0.1 mmol/L、2 h添加诱导剂、诱导温度16℃、诱导时间36 h。人源肿瘤抑素在大肠杆菌中可溶性表达为大量制备可溶性人源肿瘤抑素奠定了基础,可为功能性多肽在大肠杆菌中的可溶性表达提供借鉴。
敖龙朱玲玉庞欣辛瑜郭忠鹏朱瑞李默影顾正华郭自涛张梁
关键词:可溶性表达融合标签
RGD修饰的肿瘤抑素19肽的合成与鉴定及其对肝癌SK-Hep-1细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用
2024年
目的:探讨精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰对肿瘤抑素19肽(T-19)抗肝癌活性的影响,比较分析T-19及RGD修饰的T-19(RGD-T-19)对肝癌SK-Hep-1细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法:用Fmoc固相法合成T-19及RGD-T-19,用高效液相色谱仪和质谱进行分离、鉴定。常规培养SK-Hep-1细胞,用0、50、100、150、200、250μg/mL的T-19及RGD-T-19分别处理细胞,分为0μg/mL(对照)组、50μg/mL组、100μg/mL组、150μg/mL组、200μg/mL组、250μg/mL组。CCK-8法、克隆形成实验、划痕愈合实验和Tanswell小室实验、WB法和q PCR法分别检测SK-Hep-1细胞的增殖、迁移、侵袭能力,以及环氧合酶-2(COX-2)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、组织基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、TIMP-2蛋白和MMP-1、MMP-2 mRNA的表达。结果:经质谱鉴定,用Fmoc固相法合成的T-19及RGD-T-19纯度高。T-19和RGD-T-19均能显著抑制SK-Hep-1细胞的增殖、迁移、侵袭能力,抑制COX-2蛋白、MMP-2和MMP-9蛋白及mRNA的表达、促进TIMP-1、TIMP-2蛋白的表达(P <0.05, P <0.01, P <0.001),RGD-T-19的抑制或促进效应均明显强于T-19(均P <0.05)。结论:利用Fmoc固相法合成了纯度高、活性好的T-19及RGD-T-19,两种肽均能抑制SK-Hep-1细胞增殖、侵袭和迁移能力,RGD-T-19作用明显强于T-19。
王顺于佳琪胡月赵正林牛淑冬贾迪杨超衣同辉李淑艳
关键词:肿瘤抑素RGD序列肝癌增殖迁移肝癌
Bacteria-mediated tumor-targeted delivery of tumstatin(54-132)significantly suppresses tumor growth in mouse model by inhibiting angiogenesis and promoting apoptosis
2022年
Tumor growth is an angiogenesis-dependent process and accompanied by the formation of hypoxic areas.Tumstatin is a tumor-specific angiogenesis inhibitor that suppresses the proliferation and induces the apoptosis of tumorous vascular endothelial cells.VNP20009,an attenuated Salmonella typhimurium strain,preferentially accumulates in the hypoxic areas of solid tumors.In this study,a novel Salmonella-mediated targeted expression system of tumstatin(VNP-Tum5)was developed under the control of the hypoxia-induced J23100 promoter to obtain anti-tumor efficacy in mice.Treatment with VNP-Tum5 effectively suppressed tumor growth and prolonged survival in the mouse model of B16F10 melanoma.VNP-Tum5 exhibited a higher efficacy in inhibiting the proliferation and inducing the necrosis and apoptosis of B16F10 cells in vitro and in vivo compared with VNP(control).VNP-Tum5 significantly inhibited the proliferation and migration of mouse umbilical vascular endothelial cells to impede angiogenesis.VNP-Tum5 downregulated the expression of anti-vascular endothelial growth factor A,platelet endothelial cell adhesion molecule-1,phosphorylated phosphoinositide 3 kinase,and phosphorylated protein kinase B and upregulated the expression of cleaved-caspase 3 in tumor tissues.This study is the first to use tumstatin-transformed VNP20009 as a tumor-targeted system for treatment of melanoma by combining anti-tumor and anti-angiogenic effects.
Feifei BaoMengjie LiuWenhua GaiYuwei HuaJing LiChao HanZiyu ZaiJiahuang LiZichun Hua
关键词:TUMSTATINB16F10APOPTOSISANGIOGENESIS
肿瘤抑素19肽对SK-Hep-1细胞增殖和凋亡作用的影响
2022年
目的探讨肿瘤抑素19肽对肝癌SK-Hep-1细胞增殖能力和凋亡作用的影响。方法CCK-8检测不同浓度19肽(0、50、100、150、200、250μg/ml)对SK-Hep-1细胞增殖能力的影响。DAPI染色检测不同浓度19肽作用SK-Hep-1细胞凋亡形态学变化,流式细胞术检测不同浓度的19肽对SK-Hep-1细胞凋亡的影响。结果0、50、100、150、200、250μg/ml浓度的19肽作用SK-Hep-1细胞24 h后细胞存活率分别为(100.00±1.80)%、(95.64±1.92)%、(82.18±1.67)%、(68.43±1.39)%、(46.74±1.35)%、(42.49±1.85)%。作用48 h后细胞存活率分别为(100.00±1.80)%、(87.27±1.96)%、(66.32±1.74)%、(58.78±1.94)%、(40.40±1.44)%、(22.15±1.51)%。19肽为0μg/ml时,SK-Hep-1细胞大部分染色均匀,呈蓝色,细胞未发生凋亡。与0μg/ml相比,50、100、150、200、250μg/ml浓度的19肽作用24 h后,部分细胞呈亮蓝色,细胞核出现浓缩、破裂、碎块状致密浓染或帽点状凋亡形态。细胞凋亡率随着19肽浓度的增高而增加。结论19肽能有效抑制SK-Hep-1细胞的增殖,诱导SK-Hep-1细胞的凋亡,为新型抗肝癌药的研究和临床治疗提供理论指导。
王顺刘桃源李昂衣同辉潘洪明李淑艳
关键词:增殖凋亡肝癌
人参皂苷Rg3联合肿瘤抑素19肽对肝癌HepG2细胞凋亡的影响及机制被引量:11
2020年
目的研究人参皂苷Rg3联合肿瘤抑素19肽对肝癌HepG2细胞凋亡的影响及作用机制。方法实验为两因素两水平2×2析因设计,因素A为人参皂苷Rg3,水平为0 mg/L和40 mg/L,因素B为肿瘤抑素19肽,水平为0 mg/L和200 mg/L。CCK-8试剂盒检测肝癌HepG2细胞增殖情况;Hoechst33342染色检测细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术检测HepG2细胞凋亡率。荧光探针JC-1检测细胞的膜电位改变。Western blot法检测细胞抑癌基因磷酸酶和张力蛋白同源蛋白(PTEN)、磷酸化的磷脂酰肌醇-3激酶(p-PI3K)和磷酸化的丝氨酸/苏氨酸激酶(p-Akt)蛋白的表达变化。天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)活性测定试剂盒检测细胞Caspase-3和Caspase-9的活性。结果人参皂苷Rg3、肿瘤抑素19肽及联合用药对HepG2细胞的增殖均有抑制作用,且两者具有正协同效应;CCK-8测定人参皂苷Rg3的IC50为45.06 mg/L,肿瘤抑素19肽IC50为214.03 mg/L。Hoechst33342染色可见Rg3和19肽单用或合用时均出现细胞凋亡,并且联合用药细胞凋亡形态变化明显。流式细胞术检测细胞凋亡趋势与Hoechst33342染色结果一致,联合用药凋亡率最高。荧光探针JC-1检测表明单用或合用时细胞膜电位下降,产生绿色荧光,联合用药产生绿色荧光最为明显。联合用药更为显著上调PTEN蛋白表达,下调p-PI3K和p-Akt蛋白表达,显著增高Caspase-3和Caspase-9活性(P<0.001)。结论人参皂苷Rg3和肿瘤抑素19肽具有抑制肝癌HepG2细胞增殖,诱导其凋亡的作用,且两者具有正协同效应。其作用机制可能是通过PTEN/PI3K/Akt信号通路实现的。
衣同辉吴艳敏刘睿张春晶姚淑娟师岩李淑艳
关键词:人参皂苷RG3肝癌PTEN
肿瘤抑素T7肽溶液的稳定性研究被引量:2
2018年
目的考察水溶性肿瘤抑素T7肽在脂质体制备及贮存条件下的稳定性。方法将T7肽溶液置于室温下,HPLC法测定6 h内峰面积减小百分比,确定溶剂。再将T7肽溶液分别置于4℃和25℃下,绘制降解曲线,确定贮存条件。最后将不同pH值、含不同缓冲盐的T7肽溶液于65℃下保温1 h,检测保温前后溶液中T7肽含量,优化制备条件。结果以重蒸水和灭菌注射用水为溶剂的T7肽溶液在6 h内峰面积减少分别为79.66%和18.31%,于4℃或25℃贮存6 h后的降解率分别约为10%与20%,在pH值4.0~9.0的溶剂中降解率分别为39.67%、42.55%、37.71%、13.44%、7.34%和23.76%,与各种缓冲液接触后质量浓度均降至初始质量浓度的40%以下。结论 T7肽溶液应以弱碱性的灭菌注射用水为溶剂,现用现配,制剂制备过程中应避免与缓冲液接触,并于4℃下贮存。
李瑭熊雁蔡磊邓意辉宋艳志
关键词:药剂学PH缓冲液灭菌注射用水
tumstatin基因修饰巨核细胞联合化疗抑制肺腺癌小鼠皮下移植瘤生长
2018年
目的探讨肿瘤抑素(tumstatin)转基因巨核细胞联合化疗对肺腺癌小鼠生存率的影响和皮下移植瘤生长的抑制作用。方法制备tumstatin转基因巨核细胞,通过小鼠背部接种肺腺癌A549细胞,建立小鼠肺腺癌移植瘤模型。小鼠皮下瘤长径达到5 mm后随机分为4组:生理盐水对照组(A组,对照组),吉西他滨(GEM)化疗组(B组,单纯化疗组)、GEM联合巨核细胞组(C组)、GEM联合tumstatin转基因巨核细胞组(D组);其中B、C、D三组为治疗组。对各组小鼠分别进行给药24 d,每3 d测1次肿瘤体积。在治疗第15天眼球取血,通过血液分析仪检测血细胞值;第24天剥离瘤体,测量大小及质量,免疫组织化学法检测肿瘤内微血管密度(MVD),HE染色检测肿瘤组织坏死情况,治疗期间记录小鼠生存情况。结果各治疗组肿瘤体积生长曲线显著慢于生理盐水组,其中D组瘤体生长最慢且该组生存率较单纯化疗组(B组)得到明显提高;与其他三组相比,D组小鼠皮下瘤MVD受到显著抑制并引起肿瘤组织重度坏死,且相应小鼠体内保持较正常的血细胞水平。结论 tumstatin转基因巨核细胞联合化疗较单独化疗显著抑制肿瘤新生血管生长并可提升肺腺癌小鼠的生存率。
王章飞罗以勤李娟娄蓉
关键词:TUMSTATIN巨核细胞化疗肺腺癌
重组慢病毒LV-hTERT-tumstatin-dNK对黑色素瘤细胞A-375增殖和凋亡的影响研究被引量:1
2018年
目的构建重组慢病毒LV-hTERT-tumstatin-dNK,探讨其对黑色素瘤A-375细胞增殖和凋亡的影响。方法用不同病毒感染复数(MOI)感染黑色素瘤细胞A-375及人正常皮肤细胞HFF;以MTT法检测细胞增殖情况;并以流式细胞术检测细胞凋亡情况,同时设空白对照组。结果重组慢病毒LV-hTERT-tumstatin-dNK转染后在黑色素瘤细胞A-375中呈特异表达,在人正常皮肤细胞HFF中无表达。黑色素瘤细胞A-375的增殖随MOI增加而逐渐受到抑制,HFF细胞的增殖无明显变化。慢病毒治疗组A-375细胞凋亡明显优于对照组,而对HFF细胞无明显作用。结论重组慢病毒LV-hTERT-tumstatin-dNK可靶向促进黑色素瘤细胞A-375的细胞凋亡,并抑制其增殖。
董晓申郑新宇
关键词:重组慢病毒黑色素瘤肿瘤抑制
Tumstatin转基因巨核细胞联合吉西他滨抑制小鼠肺腺癌移植瘤生长的实验研究
背景:肺癌是恶性肿瘤的常见类型,临床治疗上常用到化疗,而化疗引起的血小板减少至今没有好的解决方法,临床常用的血小板输注经研究发现会有促进肿瘤生长和转移的风险。血小板是天然的细胞因子和生物分子的载体,血小板中含有多种血管生...
王章飞
关键词:巨核细胞TUMSTATIN肺腺癌吉西他滨
文献传递
肿瘤抑素影响血管瘤内皮细胞凋亡的相关机制分析被引量:4
2018年
目的研究肿瘤抑素对血管瘤内皮细胞的增殖与凋亡过程的调节作用,为临床婴幼儿血管瘤的治疗提供参考。方法血管瘤内皮细胞培养后随机分为5组:对照组、PD98059组、肿瘤抑制素低剂量、中剂量和高剂量组。除对照组给予生理盐水外,其余各组给予PD98059(10μM)处理2 h,肿瘤抑制素低剂量、中剂量和高剂量组分别给予1μM、10μM、100μM的肿瘤抑制素处理2 h。免疫印迹法或荧光定量法分析各组细胞凋亡相关蛋白Caspase3/9、ERK信号通路关键蛋白ERK1/2和MEK及氧化应激蛋白NOX4的表达,DHE染色法分析各组细胞的氧化应激状态。结果与对照组相比,PD98059组血管瘤内皮细胞内ROS水平明显降低、细胞凋亡蛋白Caspase3/9的表达明显升高;同时ERK信号通路关键蛋白的表达明显增强,而肿瘤抑制素低剂量、中剂量和高剂量组作用与PD98059作用一致,且具有剂量依从性。结论肿瘤抑制素通过激活氧化应激状态、ERK信号及抑制细胞凋亡蛋白通过发挥对血管瘤内皮细胞增殖的抑制作用。
方兴唐尚鸿梅文静曾雪飞
关键词:血管瘤内皮细胞肿瘤抑素氧化应激

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罗以勤
作品数:49被引量:172H指数:8
供职机构:安徽省立医院
研究主题:TUMSTATIN 肿瘤抑素 血小板 血清内皮抑素 碱性成纤维细胞生长因子
赵亮
作品数:26被引量:53H指数:4
供职机构:安徽省立医院
研究主题:TUMSTATIN 肿瘤抑素 血清内皮抑素 碱性成纤维细胞生长因子 抗环瓜氨酸肽抗体
姚丽娟
作品数:26被引量:78H指数:6
供职机构:安徽省立医院
研究主题:TUMSTATIN 肿瘤抑素 血清内皮抑素 碱性成纤维细胞生长因子 抗环瓜氨酸肽抗体
黄敏丽
作品数:76被引量:222H指数:8
供职机构:广西医科大学第一附属医院
研究主题:糖尿病视网膜病变 视网膜脱离 网膜 去整合素 TUMSTATIN
陈芳
作品数:57被引量:110H指数:5
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