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通过减毒和Red/ET同源重组构建跨界基因沉默菌株被引量：1: 2016年; "跨界基因沉默"技术是一种全新的、跨原核界与真核界的小分子RNA干扰传递技术。该技术构建了一种大肠杆菌,在这种大肠杆菌中转录的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)能够引发真核细胞内特异性基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi),所以此大肠杆菌又被称为"跨界基因沉默菌株"。"跨界基因沉默菌株"具有RNA干扰传递功能,主要得益于"跨界干扰质粒"(trans-kingdom RNAi plasmid,TRIP)。TRIP质粒主要包含inv基因、hly基因以及能够转录shRNA的基因片段。hly基因表达的listeriolysin O蛋白可以帮助细菌逃离真核细胞的吞噬体,但listeriolysin O蛋白是一种重要的毒力因子,对宿主细胞具有一定的损害。为了克服这种缺陷,在hly基因上设计了△PEST和G486D两种减毒突变。同时,为了使减毒后的TRIP质粒能够在"跨界基因沉默菌株"中稳定存在,进一步利用Red/ET同源重组将该质粒整合进大肠杆菌的基因组中。实验结果表明,减毒、整合后的"跨界基因沉默菌株"能更好地发挥RNAi作用。该技术的完善将推进工程菌的研发和利用。; 杨朝霞杨霄旭李苗苗石小亚向双林

大肠杆菌cDNA文库的构建与质量分析: 2016年; 采用Stratagene公司的cDNA文库构建试剂盒构建大肠杆菌的cDNA文库,从中筛选出与RNaseⅢ有相互作用的蛋白,为研究RNaseⅢ蛋白在原核生物中的作用奠定基础.用Trizol试剂提取大肠杆菌的总RNA,在E.coli poly（A）Polymerase作用下给mRNA特异性地加上poly（A）尾,分离纯化mRNA,利用mRNA作为模板反转录合成双链DNA.经pfx酶补平双链末端,在两端加上EcoRⅠ接头,XhoⅠ酶切消化产生粘性末端.用CHROMA SPIN-400column分级分离纯化cDNA片段,与p TRG XR载体连接后,电击转入XL1-BLUE MRF＇菌电转感受态中.得到原始文库,经计算文库的容量达到3×10^6个克隆.用PCR方法测得文库的重组率为100%,插入片段的平均长度基本位于300 bp以上,测定放大文库的滴度为：3.15×10^10pfu/m L.说明构建的大肠杆菌cDNA文库质量比较高,适合用于筛选目的基因克隆.; 肖业王婷婷向双林; 关键词：大肠杆菌 CDNA文库

HIV-1型Nef基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立被引量：1: 2017年; 为了构建艾滋病毒HIV-1型Nef基因重组表达载体,利用PCR从p NL4-3质粒上扩增HIV-1型Nef基因,获得Nef基因完整的编码区,构建可表达Nef蛋白的p EB-myc-nef重组表达载体.经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染SW480细胞,通过Western Blot技术检测Nef蛋白的瞬时表达.为了建立稳定表达Nef基因的SW480细胞系,采用G418筛选建立稳定表达细胞系的方法,筛选出单克隆细胞系.扩大培养克隆细胞后,通过RT-PCR和Western Blot分别检测Nef的mRNA转录水平及蛋白表达水平,经长达60 d的传代,最终获得稳定表达Nef基因的SW480细胞系,为研究RNAi在艾滋病治疗方面的应用提供了细胞模型.; 李苗苗杨霄旭杨朝霞向双林韩梅; 关键词：SW480细胞 G418 稳定细胞系

丙戊酸通过CREB上调脑红蛋白并保护N2a细胞免受双氧水诱导的神经损伤被引量：1: 2014年; 目的研究丙戊酸对脑红蛋白表达的影响和机制,及其对双氧水诱导的神经损伤的保护作用。方法 Western blot、RT-PCR和荧光素酶活性实验检测丙戊酸对小鼠和人脑红蛋白表达的影响;荧光素酶活性实验分析CREB在丙戊酸诱导脑红蛋白启动子活性过程中的作用;MTT实验分析丙戊酸对双氧水诱导的神经损伤的保护能力。结果发现丙戊酸上调小鼠和人脑红蛋白的蛋白和mRNA水平,并能上调脑红蛋白基因的启动子活性;CREB特异性抑制剂KG-501和CREB显性负突变体KCREB均抑制丙戊酸诱导脑红蛋白基因的启动子活性;丙戊酸可保护N2a神经瘤母细胞免受双氧水诱导的损伤。结论 CREB介导了丙戊酸诱导的脑红蛋白表达上调;脑红蛋白可能在丙戊酸保护N2a细胞免受氧化应激诱导的神经损伤过程中扮演重要作用。; 刘宁寻禹李亚丹王婷婷钟爱军姚亮元袁秀菊向双林; 关键词：丙戊酸脑红蛋白 CREB 神经损伤

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长沙市科技局科技项目(K1205221-31)