滨州医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室
- 作品数：8 被引量：2H指数：1
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- 免疫抑制受体IGSF9单克隆抗体的制备以及功能验证
- 2022年
- 目的研发靶向免疫球蛋白超家族成员9(IGSF9)的特异阻断型单克隆抗体,并验证该抗体的功能。方法将带有His标签的IGSF9细胞外结构域(IGSF9 extracellular domain,IGSF9-ECD)克隆到pcDNA3.1(-)的表达载体上,转染HEK293细胞,亲和层析获得IGSF9-ECD-His蛋白,应用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting进行蛋白鉴定。应用IGSF9-ECD-His蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠4次,ELISA和流式细胞仪检测小鼠抗血清效价。分离小鼠脾脏细胞,与小鼠多发性骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,ELISA和流式细胞仪筛选阳性克隆,并进一步筛选亚克隆细胞,制备靶向IGSF9的单克隆抗体。将IGSF9抗体加入到T细胞和THP-1细胞共培养体系中,检测上清中IFN-γ和TNF-α水平。结果IGSF9-ECD-His蛋白条带单一,分子量与预期相一致。在T细胞培养体系中加入该蛋白,显著抑制T细胞增殖。IGSF9-ECD-His蛋白免疫小鼠后,小鼠抗血清效价为1∶364500,而且抗血清能够显著逆转THP-1对T细胞的增殖抑制。本研究获取了64株克隆阳性细胞株,其中有6株能够用于流式细胞仪检测。本研究选择了阻断效应最好的5C3母克隆制备单克隆抗体,流式细胞仪和T细胞共培养结果筛选后,选择了阻断效应最好的5C3-1A4作为IGSF9单克隆抗体(anti-IGSF9),该抗体能够显著逆转IGSF9对T细胞的增殖抑制,并促进IFN-γ和TNF-α的分泌。结论本研究成功制备了IGSF9单克隆抗体,而且该抗体能够显著逆转IGSF9对T细胞增殖抑制。
- 刘祎璠赵鑫钰栾惠雯刘晓丽李尊岭
- 关键词：单克隆抗体免疫治疗
- 白细胞免疫球蛋白样受体LILRB4条件表达小鼠模型的构建
- 2022年
- 目的将灵长类动物lilrb4基因表达在小鼠髓系细胞表面,以构建人白细胞免疫球蛋白受体亚家族成员B4(LILRB4)免疫耐受小鼠,为LILRB4功能研究提供小鼠模型。方法利用NCBI数据库分析人lilrb4与小鼠Gp49b基因的同源性。在小鼠rose26基因位点通过同源重组的方式,定点插入含有LoxP位点的人lilrb4基因编码序列,获得Rosa26^(LSL/LSL)小鼠,与Lyz2-Cre小鼠进行杂交,在小鼠髓系细胞切除LoxP序列,进而启动下游人lilrb4基因的表达。应用PCR进行小鼠基因型鉴定,通过流式细胞仪检测Rose26^(LSL/LSL);Cre小鼠外周血以及骨髓中髓系细胞人LILRB4的水平。结果人lilrb4与小鼠Gp49b基因比对结果表明,无论是碱基还是氨基酸序列,两者都存在较大差异,无明显同源性。PCR结果表明,Rose26^(LSL/LSL);Cre小鼠能够检测到相应的目的条带,而且在髓系细胞条件表达人lilrb4基因,不影响小鼠的表型。流式细胞仪检测结果显示,Rose26^(LSL/LSL);Cre小鼠的髓系细胞特异性表达人LILRB4。结论Rose26^(LSL/LSL);Cre小鼠的髓系细胞中能够检测到人LILRB4的表达,本研究成功构建了人LILRB4耐受的基因敲入小鼠模型。
- 王磊赵志玲连霞金昌洙
- 关键词：髓系细胞
- 番茄红素对Fscn2基因敲除小鼠听力的保护作用
- 2023年
- 目的探讨番茄红素对Fscn2^(-/-)小鼠听力减退的保护作用。方法通过PCR技术鉴定小鼠的基因型。取1周龄的Fscn2^(-/-)小鼠20只,随机分为2组,每组10只。实验组腹腔注射(20μg/g)番茄红素(用玉米油稀释),对照组给予等量的玉米油(1.0μL/g),隔天1次,持续5周。末次注射药物48 h后,检测小鼠的听性脑干反应(ABR)阈值;耳蜗基底膜铺片,鬼笔环肽对毛细胞进行染色,观察毛细胞的变化;提取内耳蛋白,Western blot检测Bax、Bcl-2和Cleaved caspase 12在小鼠内耳中的水平。结果在不同音频(8、16、32 kHz和click)刺激下,番茄红素治疗组小鼠的ABR阈值均低于对照组,在8、16 kHz和click音频刺激下的ABR阈值差异有统计学意义(P<0.05)。毛细胞铺片发现,番茄红素治疗组小鼠耳蜗各回外毛细胞缺失率均减少,在底回的丢失率减少(P<0.05)。Western blot结果显示,番茄红素治疗组小鼠内耳凋亡相关分子(Bax和Cleaved caspase 12)水平降低,而Bcl-2表达升高。结论番茄红素治疗可以改善Fscn2^(-/-)小鼠的听力,减轻Fscn2^(-/-)小鼠外毛细胞的损害,其听力保护作用可能与抗凋亡机制有关。
- 刘荣荣李玲金安潼王艳婷商文静陈良韩锋产
- 关键词：听力减退小鼠模型毛细胞番茄红素
- 免疫抑制受体igsf 9基因敲除鼠的构建以及对肿瘤生长的影响
- 2021年
- 目的构建免疫抑制受体igsf 9基因敲除小鼠模型,并探究该小鼠模型对肺癌细胞生长的影响。方法将Cas 9 mRNA和igsf 9-sg RNA显微注射到C57BL/6小鼠受精卵中,利用非同源重组修复引入突变,造成igsf 9基因蛋白移码突变、功能缺失;应用PCR和测序技术进行基因型鉴定。将2×10^(6)个Lewis肺癌细胞(LL/2)皮下接种到C57BL/6-igsf 9^(+/+)和C57BL/6-igsf 9^(-/-)小鼠皮下,每3天检测肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线;当肿瘤体积大于2 cm^(3)时,在麻醉状态下处死小鼠,称肿瘤质量、流式细胞仪检测肿瘤组织各免疫细胞水平。结果igsf 9基因4-9外显子区域出现了2892 bp缺失,igsf 9基因发生移码突变,提前出现终止密码子,成功构建igsf 9基因敲除小鼠模型,而且该小鼠的体质量以及外周血、脾脏和骨髓中免疫细胞的比例未见明显差异。与C57BL/6-igsf 9^(+/+)小鼠相比,C57BL/6-igsf 9^(-/-)小鼠显著抑制肿瘤细胞的生长,肿瘤组织浸润,CD3^(+)T细胞、CD3^(+)/CD4^(+)T细胞、CD3^(+)/CD8^(+)T细胞水平显著升高,B细胞、中性粒细胞和巨噬细胞数量未见明显变化。结论C57BL/6小鼠敲除igsf 9基因表达能够促进肿瘤组织中T细胞的浸润或激活,从而抑制肿瘤生长。
- 孙爽刘祎璠李尊岭
- 关键词：基因敲除肺癌细胞免疫受体
- 顺铂对LTEP-a-2细胞中miR-34b、Bcl-2、Smad3表达的影响被引量：1
- 2016年
- 目的探讨顺铂对LTEP-a-2细胞内miR-34b、Bcl-2、Smad3表达的影响,明确顺铂的抗癌机制。方法体外培养LTEP-a-2细胞,实验组加入不同浓度顺铂,阴性对照组为不加顺铂的细胞;倒置显微镜观察各组细胞形态,台盼蓝染色法计算细胞存活率,MTT法测定顺铂对LTEP-a-2细胞的抑制率;实时定量PCR检测miR-34b;western blot方法分析细胞中Bcl-2及Smad3蛋白的表达变化。结果随着顺铂作用剂量的增加,LTEP-a-2细胞凋亡增加,miR-34b在顺铂作用后的细胞中的表达呈上升趋势,Bcl-2及Smad3的表达显著下降。结论顺铂可能通过上调miR-34b的表达,进一步抑制Bcl-2及Smad3的表达,导致LTEP-a-2细胞的凋亡。
- 郑瑛李有杰王萍玉庞敏张菡菡阎云飞谢书阳
- 关键词：BCL-2SMAD3肺癌顺铂
- 高分辨率溶解曲线分析miRNA-196a2基因多态性与肺癌相关性被引量：1
- 2016年
- 目的探讨microRNA-196a2基因多态性（rs1614913）与中国人群肺癌发病相关性。方法应用高分辨率溶解曲线（high resolution melting,HRM）分析技术对32例肺癌患者、27例肺部良性肿瘤患者及84例健康个体的microRNA-196a2基因多态性进行分析,并采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-restriction fragment length polymorphism,PCRRFLP）技术加以佐证。结果 micro-196a2在各组基因型分布均达到Hardy-Weinberg平衡。肺癌组C等位基因的分布频率高于对照组（P=0.0016）,OR=2.592（95%CI1.424～4.716）,说明C等位基因增加肺癌患病风险。结论 MicroRNA-196a2T/C（rs1614913）多态性增加肺癌的发病风险。MicroRNA-196a2基因多态性rs1614913可能是肺癌的一种有效的遗传标记物。
- 商文静庞敏刘越
- 关键词：肺癌单核苷酸多态性
- PLIN5通过p-AKT/p70S6K信号通路对肺癌细胞增殖的抑制作用
- 2023年
- 目的检测PLIN5在肺癌中的表达情况及作用,探讨其与p-AKT/p70S6K信号通路的关系。方法通过检索数据库资料结合免疫组化染色,分别在mRNA和蛋白水平分析PLIN5在肺癌及癌旁正常组织中的表达差异。慢病毒感染过表达PLIN5和用siRNA敲低PLIN5在肺癌细胞系A549和NCI-H1299中表达后,CCK-8活力检测细胞增殖能力变化;比色法检测细胞ATP含量变化;流式细胞术检测活性氧含量变化;Western blot检测p-AKT/p70S6K信号通路相关蛋白变化。结果公共数据库资料和免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,在肺癌组织中PLIN5表达下调。过表达PLIN5后细胞增殖受到抑制,敲低PLIN5后细胞增殖能力上升。ATP含量检测显示PLIN5降低细胞内ATP含量水平。活性氧含量检测显示PLIN5上调细胞内活性氧含量水平。PLIN5降低p-AKT(Ser473),p-AKT(Thr308),p70S6K蛋白水平表达。结论PLIN5通过p-AKT/p70S6K信号通路在肺癌生长增殖中起抑制作用。
- 黄荣坤马颖郭若雨杨淑芯胡金霞孔丽君
- 关键词：肺癌增殖
- Fscn_(2)基因过表达对顺铂诱导的耳蜗细胞凋亡的抑制作用
- 2022年
- 目的研究Fscn_(2)基因的过表达对顺铂诱导耳蜗细胞凋亡的影响。方法构建Fscn_(2)过表达的细胞模型,用30μM的顺铂干预Fscn_(2)过表达的细胞和对照组E.V.细胞24 h,CCK-8法检测细胞的增殖能力以及流式细胞术检测细胞凋亡率,Western Blot检测凋亡相关蛋白。结果在顺铂干预下,与对照组细胞相比,Fscn_(2)过表达的细胞增殖能力较强,凋亡细胞较少,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达较高,凋亡相关蛋白Cleaved caspase3的表达较低。结论Fscn_(2)基因的过表达抑制了顺铂诱导的耳蜗细胞凋亡。
- 王岩商文静韩锋产
- 关键词：顺铂细胞增殖细胞凋亡
