华南农业大学兽医学院广东省宠物工程技术研究中心
- 作品数：4 被引量：4H指数：1
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- 敲低内源性PERK基因对犬细小病毒复制的影响
- 2023年
- 利用新型CRISPR interference(CRISPRi)技术进行蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)目的基因PERK的敲低。首先,利用慢病毒包装系统经嘌呤霉素筛选后构建稳定表达dCas9-KRAB蛋白的MDCK细胞株。然后,设计靶向PERK转录起始位点(transcription start site, TSS)的特异性小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),向该稳转细胞株转染表达sgRNA的质粒,通过qPCR检测PERK的mRNA表达水平;同时,内质网应激激活剂衣霉素(tunicamycin, Tu)处理该细胞后,通过qPCR检测PERK通路下游GRP78、GRP94、ATF4、GADD34和CHOP等基因mRNA的表达水平。最后,将犬细小病毒2型(canine parvovirus type 2,CPV-2)接种于PERK敲低的MDCK细胞株,通过绝对定量PCR测定不同时间点CPV-2的复制水平。结果表明,敲低PERK基因表达后,CPV-2的复制水平显著下降,说明PERK参与调控CPV-2的复制。以上结果为进一步探究内质网未折叠蛋白反应(endoplasmic reticulum unfolded protein response, UPR^(ER))对CPV-2复制的影响及病毒与宿主相互作用的分子机制研究奠定了基础。
- 李艳超郝香琪周沛
- 关键词：PERK
- 犬圆环病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用
- 2023年
- 建立了犬圆环病毒(canine circovirus,CanineCV)EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法。用PCR方法克隆CanineCVRep基因中的高保守区,扩增的目的片段大小为217bp,将其克隆至pMD18-T载体上,构建PCR检测阳性参考质粒,并用阳性参考质粒,进行各项反应条件优化。建立的标准曲线呈现出较高拟合性的线性回归,R2值为0.9995;该方法检测灵敏度为3.88×10^(1) copies/μL;在重复性试验中,组内和组间重复变异系数均小于2%,表明该方法具有良好的重复性;该方法对犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬流感病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型、犬冠状病毒等犬常见病原的检测均无交叉反应;临床样本检测表明,所建立的EvaGreen实时荧光定量PCR对CanineCV的阳性检出率为2.82%(5/177),高于普通PCR检测的CanineCV阳性率1.13%(2/177)。本研究成功建立了一种用于快速检测CanineCV的EvaGreen qPCR方法,该方法安全且具有较好的特异性、敏感性和重复性,可作为CanineCV感染的病原学检测工具。
- 董杰刘若寒李守军周沛
- 关键词：实时荧光定量PCR
- 小动物医师人才培养实践教学新模式探讨被引量：4
- 2017年
- 随着中国宠物产业的快速发展,以及全国范围实施执业兽医资格考试制度,宠物临床诊疗工作对优秀小动物医师的需要量越来越大,这也促进了我国高校对培养合格执业兽医人才的重视。笔者主要结合动物医学专业小动物疾病防治方向人才培养现状,就加强小动物医学专业教学改革与提高临床实践技能等进行探讨,以共同提高我国小动物医师人才培养质量。
- 石达友吴玄光陈义洲贾坤李少川李守军孙永学
- 关键词：执业兽医教学改革临床实践技能
- 广东省牛流行热病毒分离株JM 2020的全基因组测序及进化分析
- 2023年
- [目的]分析广东省牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus,BEFV)分离株JM 2020与其他地区毒株的进化关系,阐明遗传进化与全基因组的特征,为中国乃至世界对牛流行热疾病的流行情况以及预防该疾病提供有用信息。[方法]根据从GenBank下载的BEFV毒株的全基因组序列信息,设计引物PCR扩增糖蛋白(Glycoprotein,G)基因;另设计10对引物用于扩增全基因组,送测序得到10个片段的基因序列,运用DNAStar软件中的EditSeq手动编辑和拼接获得全基因组序列。运用MEGA 6.0分别构建G基因和全基因组进化树进行进化分析。[结果]JM 2020毒株的G基因和全基因组与泰国毒株的核苷酸序列相似性均最高,分别为94.9%~99.3%和99.0%,进化分析表明JM 2020与2013—2017年泰国毒株处于同一小分支,而与JB76H、JT02L等国内毒株有一定进化距离。全基因组测序结果表明,JM 2020全基因组长度为14 902个核苷酸(nt),包括50 nt的前导序列,1 296 nt的核蛋白(Nucleoprotein,N)基因,837 nt的磷蛋白(Phosphoprotein,P)基因,672nt的基质蛋白(Matrixprotein,M)基因,1 872 nt的G基因,1 812 nt的非结构糖蛋白II (Non-structural glycoprotein II,GNS)基因,618 nt的α1、α2基因,444 nt的β基因,345 nt的γ基因,444 nt的RNA依赖性聚合酶(Large multi-functional enzyme,L)基因和73 nt的尾随序列,且分别被21、47、68、67、23、64、59、79和35nt的区域隔开。JM 2020、qy2017及泰国毒株均出现P′基因(P基因多顺反子产物)截断的特征。[结论]JM2020毒株与2017年分离毒株qy2017序列相似性高且均与泰国毒株进化关系较近,与JB76H等我国其他地区毒株有一定进化距离。该研究丰富了中国BEFV流行株的基因组信息,为牛流行热疫病综合防控及开发新疫苗奠定了基础。
- 贾荣荣汪祥斌贾坤
- 关键词：牛流行热病毒G基因进化分析全基因组序列分析
