湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
- 发文基金：国家自然科学基金湖南省研究生科研创新项目更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 果蝇Domeless蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究
- 2013年
- 在果蝇(Drosophila melanogaster)的研究中发现Domeless接受器参与发育期间的JAK/STAT信号调节,在心脏疾病的发生机制中发挥重要作用.为了克隆Domeless,我们利用生物信息学选择果蝇Domeless基因抗原亲水区,将扩增出的PCR片段克隆到原核表达pET-28a载体中,转入E.coli(Escherichia coli)中后通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactoside)诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-Domeless融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.用Western blot检测抗体的效价和特异性.获得了Domeless原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Domeless多克隆抗体,为后续Domeless功能研究奠定了基础.
- 唐超任恋刘宪楚李容江志钢赵阳廖四芳袁佳佳莫小阳吴秀山
- 关键词：果蝇原核表达多克隆抗体
- 斑马鱼心脏发育候选基因Klhl31的TALEN打靶有效性分析
- 2016年
- TALEN(transcription activator-like effector nuclease)打靶是一种定向敲除基因技术,利用该技术能解决目前在斑马鱼体内难以进行基因敲除的难题。Klhl31是本实验室鉴定的人类心脏发育候选基因,且目前国内外尚无斑马鱼Klhl31敲除品系。为了在斑马鱼的整体水平鉴定Klhl31的生物学功能,我们利用TALEN打靶技术建立斑马鱼Klhl31基因敲除品系。酶切验证的结果显示,注射了TALEN表达质粒的胚胎在酶切位点处发生了基因突变,该突变破坏了酶切位点导致酶切出现阳性结果,证明了TALEN打靶的有效性。对F0代突变体成鱼的筛选过程中,经酶切验证,同样出现了阳性结果。这些结果说明用TALEN这种技术成功敲除了斑马鱼Klhl31基因,获得了Klhl31基因敲除的嵌合体斑马鱼。
- 蔡湾湾陈发万永奇吴秀山邓云袁婺洲
- 关键词：TALEN酶切位点基因敲除
- 针对Fbxl5基因关键结构域F-box的Crispr/Cas9打靶有效性分析被引量：1
- 2016年
- 为了在动物体内研究Fbxl5基因是通过什么机制导致斑马鱼心脏出现突变表型,本文利用近几年兴起的CRISPR/Cas9打靶技术建立斑马鱼Fbxl5基因敲除品系。本文将打靶位点定位于Fbxl5的F-box结构域,也就是Fbxl5的第五号外显子上。首先经过基因打靶网站分析筛选出针对Fbxl5基因F-box结构域最适合的打靶位点,扩增出Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶双链DNA,并转录为RNA,与Hcas9共注射至斑马鱼胚胎。最后,在注射48 h后对Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶的有效性进行检测。首先在注射48 h之后收集胚胎提取基因组DNA,用特异性引物进行PCR扩增;将纯化后的Fbxl5基因PCR产物连接到p MD18-T载体,再经质粒提取,测序分析,通过与WT斑马鱼基因组序列进行比对发现Fbxl5-9号在PAM序列AGG下游缺失了4个碱基。证明该CRISPR/Cas9系统在敲除心脏发育候选基因Fbxl5是有效的,该研究为最终获得Fbxl5基因敲除斑马鱼奠定了良好的基础。
- 高晶邓云陈宇高建芳傅雪珂尹丽阳万永奇吴秀山李永青
- 关键词：基因敲除
