湖南师范大学医学院分子生物学研究室
- 作品数：9 被引量：10H指数：2
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- 重组结核分枝杆菌TB10.4的纳米金生物传感器诊断结核病
- 目的：克隆和表达结核分枝杆菌TB 10.4,构建基于TB 10.4的纳米金生物传感器,评价其诊断结核病的能力.方法：自结核分枝杆菌标准株H37Rv提取基因组DNA,采用聚合酶链反应扩增TB10.4基因,克隆至pMD-18...
- 袁仕善
- 旋毛形线虫肌幼虫代谢分泌抗原的鉴定被引量：1
- 2016年
- 目的采用免疫共沉淀偶联质谱技术分离和鉴定旋毛形线虫肌幼虫代谢分泌抗原中的血清学抗原。方法收集感染旋毛形线虫的新西兰兔血清,硫酸铵沉淀法分离血清Ig G;从感染肌肉中分离纯化肌幼虫并培养收集代谢分泌抗原。免疫共沉淀和SDS-PAGE分离代谢分泌抗原,Western blot法分析血清学抗原,并予质谱鉴定。结果间接ELISA检测旋毛形线虫感染新西兰兔的血清抗体滴度达1∶6400以上;采用硫酸铵沉淀法获得血清Ig G。免疫共沉淀的旋毛形线虫肌幼虫代谢分泌抗原经电泳分离获得4条较清晰的蛋白质条带,Western blot法分析发现在相对分子质量(Mr)40 000、50 000、83 000处存在旋毛形线虫感染血清识别、而正常兔血清不识别的3条较强的蛋白质条带。切取Mr40 000、50 000、83 000处的蛋白质条带进行质谱鉴定,获得4种蛋白质分子,分别为丝氨酸蛋白酶、肌幼虫特异性丝氨酸蛋白酶、43 000分泌糖蛋白、53 000代谢分泌抗原。结论采用免疫共沉淀偶联质谱技术从旋毛形线虫肌幼虫代谢分泌抗原(ES)中获得4种血清学抗原,为旋毛形线虫病有效诊断和疫苗候选分子的获得提供了新的来源和视角。
- 黄学贵贺莉芳袁仕善刘晖王鑫
- 关键词：旋毛形线虫免疫共沉淀质谱技术
- 重组分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32的表达及其抗原性被引量：2
- 2010年
- 目的重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT6的融合蛋白及卡介苗(BCG)CFP32,分析其抗原性。方法用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因。经克隆和测序分析后,分别亚克隆至表达载体pQE-30和pET-23a(+),在大肠埃希菌BL21中表达重组蛋白,予以纯化、鉴定,Western blot和间接ELISA分析重组蛋白的抗原性。结果构建了重组表达质粒pQE30-cfp10-esat6和pET-cfp32,表达了CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32。CFP10-ESAT6蛋白表达量约占菌体总蛋白的15.2%,纯化后蛋白纯度约为92%,浓度为0.456g/L;CFP32蛋白表达量约占菌体总蛋白的10.6%,纯化后蛋白纯度约为90%,浓度为0.310g/L。纯化CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32检测结核病的敏感性分别为85.7%和71.4%,特异性均为100%。结论重组表达获得具有良好抗原性的重组融合蛋白CFP10-ESAT6和重组蛋白CFP32。
- 孙文霞谭云洪袁仕善谭笑夏燕陈婧
- 关键词：重组融合蛋白质类细菌蛋白质类
- 结核分枝杆菌抗原模拟肽的筛选和鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的应用噬菌体随机12肽库免疫淘筛结核分枝杆菌抗原模拟肽。方法以结核患者血清IgG为靶分子，3轮淘筛噬菌体随机12肽库，ELISA鉴定阳性噬菌体克隆，并进行测序分析。选择高频出现的阳性克隆用ELISA法初步分析其诊断能力。结果经3轮免疫筛选，噬菌体得到有效富集，12个阳性噬菌体克隆经测序分析获得6种短肽序列。高频出现的两个阳性克隆诊断结核病的敏感性分别为71．4％（A2）和55．4％（A7）。结论结核患者血清IgG筛选噬菌体随机12肽库获得了能结合抗结核抗体的噬菌体展示短肽。
- 孙文霞袁仕善谭云洪张小萍余艳艳
- 关键词：结核分枝杆菌噬菌体随机肽库模拟肽
- 结核病诊断性血清学特异抗原的筛选和鉴定被引量：2
- 2019年
- 目的筛选和鉴定结核病患者血清抗体特异性识别的结核分枝杆菌抗原。方法于改良罗氏培养基中培养结核分枝杆菌标准株H37Rv 4周,收集菌体,通过冰浴超声法提取结核分枝杆菌菌体抗原。收集2013年2—7月湖南省结核病防治所首次入院的30例初治结核病患者的血清,以及收集2013年7月湖南省人民医院检验科接收的20名健康体检者的血清。通过饱和硫酸铵沉淀法提取纳入的20例结核病患者的血清IgG,从结核分枝杆菌菌体抗原中免疫共沉淀血清学抗原,以纳入的其余10例结核病患者血清免疫印迹(Western blot,WB)验证其免疫反应性;从十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶上切割阳性反应的蛋白质条带,通过串联质谱技术进行鉴定。结果免疫共沉淀获得1条相对分子质量为16000(16kDa)、能被结核病患者血清抗体特异性识别的蛋白质条带;经串联质谱鉴定,获得结核分枝杆菌热休克蛋白(heat shock protein,Hsp)16.3、糖基转移酶蛋白、铁调控Lsr2蛋白前体等3种蛋白抗原。结论采用免疫共沉淀偶联质谱技术获得3种结核分枝杆菌血清学抗原,可为结核病血清学诊断性抗原的选择进一步提供依据。
- 杨双郭婧玮胡一敏谭云洪谭笑袁仕善
- 关键词：分枝杆菌血清学抗原免疫沉淀法串联质谱法
- 结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建
- 2006年
- 目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。
- 胡毅唐小异袁仕善陈宇
- 关键词：结核分支杆菌质粒
- 日本血吸虫SJCHGC02377蛋白部分片段的克隆与表达
- 2008年
- 目的:克隆和表达日本血吸虫SJCHGC02377蛋白。方法:采用RT-PCR从日本血吸虫成虫总RNA中扩增出编码SJCHGC02377蛋白的基因片段;经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23 a(+),转化大肠埃希菌BL21,菌落PCR和双酶切鉴定;阳性菌株经IPTG诱导表达SJCHGC02377蛋白部分片段,亲和层析予以纯化。结果:RT-PCR扩增出SJCH-GC02377蛋白基因片段;获得的阳性克隆序列与GenBank中登录的日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的基因序列一致;SJCH-GC02377蛋白基因被亚克隆到原核表达载体pET-23 a(+),在BL21中获得了表达,表达的蛋白经亲和层析获得纯化。结论:成功构建了日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的重组表达质粒,在大肠埃希菌中获得表达。
- 袁仕善孙文霞杨盛清唐小异
- 关键词：日本血吸虫克隆
- 日本血吸虫成虫性别差异蛋白的筛选及鉴定被引量：3
- 2009年
- 目的筛选和鉴定日本血吸虫成虫性别差异蛋白。方法自日本血吸虫（Schistosoma japonicum，S．japonicum）尾蚴感染的2只家兔颈动脉灌注生理盐水冲虫，分别收集雌雄成虫各约200条。提取雌、雄成虫的水溶性和脂溶性蛋白各300μg，采用双向凝胶电泳技术分别进行分离。银染后扫描成像，用Image Master Platinum 2D 5．0软件进行分析，筛选差异蛋白，并予质谱鉴定。结果雌虫和雄虫的水溶性蛋白分别检出（255±10）、（224±12）个蛋白点，疏水蛋白分别检出（200±11）、（132±8）个蛋白点；鉴定的6个差异蛋白质中，5个雌性表达上调的差异蛋白为硫氧还蛋白，铁蛋白-1重链，泛素结合酶样蛋白Mms 2-泛素复合体可溶性结构B链，热休克蛋白10和胞浆脂肪酸结合蛋白突变体H，1个雄性表达上调的差异蛋白为48kDa组胺受体亚基肽4。结论获得了日本血吸虫成虫性别差异蛋白质。
- 袁仕善邢秀梅刘建军黄琼瑶杨盛清彭飞
- 关键词：血吸虫蛋白质组电泳质谱分析法
- 重组结核分枝杆菌ESAT-6的克隆与表达被引量：1
- 2013年
- 目的:克隆和表达结核分枝杆菌ESAT-6。方法:以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序。将esat-6基因亚克隆至pET-28a,构建pET-esat-6重组质粒,转化入大肠杆菌BL21感受态,PCR和双酶切鉴定阳性克隆,经IPTG诱导表达,用His-bindTM亲和层析柱纯化ESAT-6,SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果:PCR扩增出esat-6基因的特异片段,成功构建重组表达质粒pET-esat-6,并在BL21获得表达,纯化的ESAT-6能被结核病人血清所识别。结论:成功克隆和表达获得重组蛋白ESAT-6。
- 袁仕善邓志高谭云洪杨双王云孙文霞
- 关键词：结核分枝杆菌ESAT-6克隆
