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鸡复等位基因BF2与β2m的结构解析: 2006年; 为了阐明鸡主要组织相容性复合体I(BF)和β2微球蛋白(β2m)不同复等位基因的分子结构,利用pMAL-p2X／E．coli TB1系统表达了5类不同复等位基因BF2的胞外区和一类新的β2m,并采用纯化、蛋白酶切和Western blot进行了鉴定．最后,采用圆二色谱(CD)测定了各重组蛋白的二级结构以及同源模建了其三级结构．5类不同复等位基因的BF2蛋白分子中的α-螺旋、β-片层、转角和随机卷曲的氨基酸长度分别为69—73,67—72,35—37和94—98．5类不同复等位基因BF2和一类新的β2m蛋白分子的同源模建揭示了其结构与人和鼠的MHC I类分子类似,但各有其特征性的结构;研究获得了正确折叠、不同复等位基因的BF2和β2m蛋白分子,并为进一步形成BF2-β2m复合体、鉴定抗原表位提供了依据．; 李新生闫若潜高风山方勤美李云岗郝惠芳夏春; 关键词：Β2M 圆二色谱同源模建

H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的表达及纯化被引量：9: 2008年; 利用PCR方法从含禽流感病毒HA基因的质粒T-HA上扩增HA基因,再将其克隆到原核表达载体pET28a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为60kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV血凝素抗体具有良好的灵敏性。; 李清州郝惠芳王丽赵绪永朱礼倩张丽萍邓瑞广张改平; 关键词：禽流感病毒 H5N1亚型原核表达

一商品猪SLA-Ⅰ分子复合体的体外构建被引量：2: 2009年; 【目的】研究中国北方杂交商品猪SLA-Ⅰ类分子结构特点,并为进一步的多肽结合等功能研究奠定基础,需要在体外构建正确折叠的SLA-I类分子复合体。【方法】以长白-达兰商品猪为研究材料,克隆SLA-2和β2m。然后采用剪接重叠延伸PCR(splicingoverlapextentionPCR,SOEPCR)法,将SLA-2的胞外区和β2m的成熟肽部分通过一富含甘氨酸/丝氨酸的Linker(G4S)3连接,形成SLA-2-Linker-β2m全长,并插入原核表达质粒pMAL-p2X,转化E.coliTB1,IPTG诱导表达。表达得到的融合蛋白分别经过Western-blot、纯化及FactorXa切割,分离纯化单体蛋白。圆二色谱(circulardichroismspectrum,CD)测定蛋白的二级结构。【结果】SDS-PAGE和Western-blot均证实融合蛋白MBP-SLA-Ⅰ大小为84.1kD。SLA-I单体蛋白大小为41.6kD。圆二色谱分析单体蛋白和融合蛋白二级结构元件α-螺旋、β-折叠、转角和随机卷曲的符合率分别达到了100%、90.6%、88.5%和96.9%。【结论】结果表明重构的SLA-I复合体具有正确的二级结构,可以用于体外多肽结合等研究。; 高凤山李新生李云岗郝惠芳方勤美夏春; 关键词：复合体圆二色谱

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的表达及纯化被引量：4: 2008年; 参考GenBank上发表的H5亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)基因序列设计引物,PCR扩增NA基因,再将其克隆到原核表达载体pET-32a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为61 kDa,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性。; 张改平李清州郝惠芳周玲王丽杨苏珍罗俊冯丽丽; 关键词：禽流感病毒 H5亚型

珍珠鸡MHC Ⅰ轻链基因的克隆、可溶性表达与纯化被引量：1: 2006年; 为了构建珍珠鸡MHCⅠ轻链β2m成熟肽基因的原核表达载体并在大肠杆菌中实现可溶性的表达,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从鸡脾脏中提取总RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用T aK aR a AM V反转录酶合成F irst-strand cDNA(fcDNA)。根据G enB ank中登录的鸡的β2m基因序列,设计了分别含E coRⅠ和H indⅢ酶切位点的一对引物,分别扩增鸡β2m的成熟肽基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含L acZ基因的原核克隆载体pGEM-T E asy中,转化至大肠杆菌JM 109感受态细胞,经E coRⅠ和H indⅢ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片断亚克隆到表达载体pM AL-p2X,构建重组表达质粒p2Xβ-2m。将重组表达质粒转化入大肠杆菌E.coli TB 1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了鸡β2m成熟肽基因序列,全长约297bp,编码约98个氨基酸,并可溶性表达了鸡β2m成熟肽蛋白质分子。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了W estern b lot鉴定。本研究为进一步利用BF 2的胞外区在体外共同构建MHCⅠ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。; 李新生闫若潜方勤美郝惠芳崔沛高风山李云岗徐守振夏春; 关键词：珍珠鸡轻链可溶性表达

我国一杂交商品猪IgM恒定区CH3-CH4亚区的克隆与表达被引量：10: 2006年; 高凤山曹海虹李新生李云岗郝惠芳夏春; 关键词：IGM抗体商品猪杂交 PCR扩增

重叠延伸PCR法体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ被引量：2: 2006年; 本研究旨在体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(MHCⅠ)重链(α链)胞外区与轻链(β2m)成熟肽的重组嵌合分子。采用RT-PCR法分别扩增鸡MHCⅠ的重链胞外区和轻链的成熟肽序列;采用重叠延伸PCR(Splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR)把通过45个碱基的链连接的鸡MHCⅠ重链胞外区基因和轻链成熟肽基因重组到可溶性表达质粒pMAL-p2X进行可溶性表达。经琼脂糖凝胶电泳证明RT-PCR可分别扩增出鸡MHCⅠα链胞外区基因和β2m成熟肽基因,大小符合预期。采用MHCⅠα链胞外区序列的反义引物与β2m成熟肽基因正义引物有15个碱基重叠的两对引物,以MHCⅠα链胞外区序列与β2m成熟肽序列PCR产物的混合物作为模板,进行重叠延伸获得了预期大小的连接片段;测序显示重组质粒上MHCⅠα链胞外区序列与轻链β2m成熟肽基因的靶序列由一柔性的linker相连,阅读框正确且无移码。本研究表明SOE-PCR是体外重构鸡MHCⅠ的一种简捷可行方法。; 李新生闫若潜高风山方勤美郝惠芳李云岗陈红英夏春; 关键词：重链重叠延伸PCR

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郝惠芳

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