关海容
- 作品数：9 被引量：10H指数：2
- 供职机构：解放军第307医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的表达优化被引量：2
- 2005年
- 目的:我们所研创的pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21pLysE工程菌通常情况下更多的是以包涵体形式为主,而少部分为可溶形式,本研究试图在不改变其结构而仅通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素而获得稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白。方法:针对更换不同的培养基、降低或升高诱导温度、增加或减少IPTG的用量、延长或缩短诱导时间等诸多能够增加可溶性表达量的各种因素进行较为系统的探索。结果:该工程菌在无压力选择条件下传代50代后的表达稳定性约为60%;通过大量对比研究,我们最终确定了pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21pLysE菌种的最佳培养诱导表达方案:即过夜活化的菌种以2%浓度接种于2YT培养基,22℃培养至D值约为0.4时加入0.1mmol/LIPTG,诱导12h,由此可获得较高水平的、稳定的、几乎全部为可溶性表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白,目的蛋白量占菌体总蛋白的≥24%。结论:通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素,获得了稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的工程菌,为进一步有效分离纯化该蛋白奠定了基础。
- 关海容孙玉英袁志宏张惠丽梁飞刘楠郭斯启习彩霞奚永志
- 关键词：工程菌株免疫抑制基因表达
- 新型重组免疫抑制蛋白B7-2-L-PE40KDEL的分子构建与生物活性及结构特性被引量：5
- 2002年
- 目的 构建重组B7 2 L PE4 0KDEL融合蛋白 ,特异性杀伤CD2 8高表达的T细胞 ,选择性阻断T淋巴细胞活化过程中的B7:CD2 8/CTLA 4共刺激信号系统 ,由此诱导免疫耐受 ,特异性防治移植物抗宿主疾病 (GVHD)和宿主抗移植物疾病 (HVGD)。方法 采用基因融合序列重叠延伸 (SOE)策略 ,构建新型重组pRSETA B7 2 L PE4 0KDEL外毒素融合蛋白的原核表达载体 ,实现融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 ,利用亲和层析等方法进行蛋白质纯化。对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性等进行模拟分析。采用MTT法对其特异性杀伤高表达CD2 8受体的T细胞的活性进行测定。结果 构建并高效表达了B7 2 L PE4 0KDEL融合蛋白 ,所获融合蛋白的纯度大于 95 %。该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示 ,其柔性及抗原性、亲水性表位均未显著改变。活性测定显示 ,该重组融合蛋白能有效特异性地杀伤高表达CD2 8的人T淋巴瘤细胞系 ,而对未表达CD2 8的人白血病细胞系则无任何杀伤。结论 具有靶向性免疫抑制活性的新型重组B7 2 L PE4 0KDEL外毒素融合蛋白的构建、表达对特异性防治GVHD和HVGD可能产生积极的影响。
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- 关键词：生物活性淋巴细胞转化移植物抗宿主病免疫耐受
- 新型重组融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL部分表征的鉴定
- 2008年
- 目的:对构建的新型重组B7-2-PE40KDEL外毒素融合蛋白的部分表征进行分析鉴定。方法:采用SDS-PAGE相对分子量、胰蛋白酶消化的MALDI-TOF-MS质谱、蛋白印迹、全波长扫描和MTT法分别测定该融合蛋白相对分子量、肽谱、抗原特异性以及靶向杀伤生物学活性。结果:B7-2-PE40KDEL经12%SDS-PAGE蛋白电泳和凝胶成像系统分析计算,其相对分子量为72628,与理论预测值69561相比误差在5%之内;全波长扫描分析显示该目的蛋白分别在225nm和276nm处各有一吸收峰;MALTI-TOF-MS质谱测定共获得15个与理论预测值相符的肽段,经瑞士生物信息研究所的EXPASY分子生物服务网站的Peptident数据库搜索证明,在分子量为60000～80000的范围内未检索到与上述条件相符的已知蛋白,证明本融合蛋白为全新蛋白,与我们预测的目的蛋白相符;Westernblot实验显示B7-2-PE40KDEL能与人B7-2及PEA抗体特异性结合;MTT杀伤活性测定表明,该融合蛋白对表达CD28+的人T淋巴瘤细胞系Jurkat产生特异性杀伤,而对不表达的CD28-淋巴细胞系Raji无任何杀伤。结论:重组B7-2-PE40KDEL外毒素融合蛋白为一全新的具有靶向B7:CD28细胞杀伤活性的蛋白质。
- 关海容孙玉英袁志宏张惠丽梁飞刘楠郭斯启习彩霞奚永志
- 关键词：肽谱抗原特异性生物学活性
- 新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的表达、纯化及部分物化表征鉴定
- 该研究旨对我们已构建成功的pRSETa-B7-2-PE40KDEL原核表达载体的表达条件进行优化,以期获得稳定、高效尤其是可溶性形式的表达：探索出一条快捷高效能获得大量高纯度重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯...
- 关海容
- 关键词：移植物抗宿主病细胞毒作用
- 文献传递
- 一种新型免疫抑制融合蛋白、其编码核酸及其用途
- 本发明涉及一种新型免疫抑制融合蛋白、其编码核酸及其用途。
- 奚永志袁志宏张惠丽关海容孔繁华
- 文献传递
- 一种新型免疫抑制融合蛋白、其编码核酸及其用途
- 本发明涉及一种新型免疫抑制融合蛋白，其中含有免疫配基或其功能性片段、变体、类似物或衍生物与毒素蛋白的融合体。该融合蛋白能够特异性地靶向淋巴细胞，选择性杀伤参与移植排斥或自身免疫疾病的淋巴细胞。本发明还涉及编码所述融合蛋白...
- 奚永志袁志宏张惠丽关海容孔繁华
- 文献传递
- 靶向B_7/CD_(28)信号系统治疗自身免疫性疾病的新策略被引量：1
- 2001年
- 关海容孙玉英奚永志
- 关键词：自身免疫性疾病
- 靶向B7/CD28共刺激信号系统防治移植物抗宿主病的新策略被引量：3
- 2002年
- 关海容奚永志
- 关键词：移植物抗宿主病
- 新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的分离纯化被引量：2
- 2006年
- 为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线,比较了不同组合的纯化策略和条件,包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等,并采用MTT法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性。结果表明,在反相层析分离中疏水相分别采用了常规的甲醇和乙腈,结果为所分离的该重组融合蛋白均发生了变性,从色谱柱中分离出来就生成了絮状沉淀。在蓝染料亲和层析一步分离中,由于全菌体蛋白中与亲和树脂发生非特异结合的成分较多,极难区分目的蛋白和杂蛋白。但是,PRSETA-B7-2-PE40KDEL表达载体上带有翻译增强序列T7-g10,可在表达目的蛋白N端融合6个组氨酸,这十分有利于通过Ni-NTA金属鏊和层析法快速高纯度地纯化表达产物。根据这一特性,经反复筛选实验设计最终确定了金属螯合层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步法的纯化路线,用于纯化分离B7-2-PE40KDEL融合蛋白。所得的目的蛋白的纯度可达95%以上,总回收率为8%。Western-blot实验显示,所得蛋白可与B7-2及PEA抗体特异性结合;MTT生物活性测定表明,该融合蛋白对表达CD28受体的人T细胞系Jurkat产生特异性杀伤作用,而对不表达CD28的淋巴细胞系Raji无任何杀伤作用。结论:建立了高效快速纯化大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的技术路线,所纯化的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白能特异性靶向杀伤表达CD28受体的人T细胞。
- 关海容孙玉英袁志宏张惠丽梁飞刘楠郭斯启习彩霞奚永志
- 关键词：蛋白纯化靶向杀伤生物活性
