王中安
- 作品数：4 被引量：4H指数：1
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- 利用大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶去除重组人干扰素-α2b N端的起始甲硫氨酸被引量：1
- 2012年
- 目的构建重组大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶(re-MAP)的原核表达体系,并利用表达的reMAP切除重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)N末端的初始甲硫氨酸。方法将PCR扩增得到的大肠杆菌MAP基因克隆到表达载体质粒pACYCDuet-1中,并在宿主菌E.coli BL21中通过IPTG诱导进行可溶性表达,经SDS-PAGE和Western blot分析及活性检测后,通过两种方法作用rhIFN-α2b:①将纯化后reMAP和rhIFN-α2b在体外适当的缓冲液中作用;②构建reMAP和rhIFN-α2b的共表达体系,实现在细胞内对rhIFN-α2b进行作用,并对两种作用方式的结果进行比较。结果 reMAP和rhIFN-α2b均得到正确表达,酶活性检测结果表明reMAP具有水解N端甲硫氨酸的活性,两种方法作用后的rhIFN-α2b经氨基酸序列测定后显示N端起始甲硫氨酸均被切除,其中体内作用切除率>94%、体外作用切除率>96%。结论 reMAP可以用于rhIFN-α2b N末端的初始甲硫氨酸的切除。
- 王中安邹文艺刘磊范清林宋礼华
- 关键词：干扰素-Α2B基因表达大肠杆菌
- 利用大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶去除重组人干扰素-α2b N端的起始甲硫氨酸
- 2012年
- 目的获取大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶(re-MAP)基因,构建重组大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶的原核高表达载体pACYCDuet-1-MAP,利用大肠杆菌BL21作为宿主菌进行原核表达,并利用表达的reMAP切除重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)N末端的初始甲硫氨酸。方法提取大肠杆菌BL21基因组作为模板,用PCR方法扩增得到大肠杆菌MAP基因,并克隆到载体质粒pGEM-7zf(-)中,将重组质粒pGEM-7zf(-)-MAP转化感受态大肠杆菌DH5α,蓝-白斑筛选及测序验证正确后,将reMAP基因克隆至表达载体质粒pACYCDuet-1,Nco I/BamH I双酶切及PCR验证正确后,将重组表达质粒pACYC-Duet-1-MAP转化至感受态大肠杆菌BL21中,筛选得到阳性克隆通过IPTG诱导进行可溶性表达,经SDS-PAGE和Western blot分析及活性检测后,通过两种方法作用rhIFN-α2b:①将纯化后reMAP和rhIFN-α2b在体外适当的缓冲液中作用;②构建re-MAP和rhIFN-α2b的共表达体系,实现在细胞内对rhIFN-α2b进行作用,并对两种作用方式的结果进行比较。结果 Nco I/BamH I双酶切、PCR验证及测序结果表明重组表达质粒pACYCDuet-1-MAP构建成功;SDS-PAGE和Western blot分析结果表明re-MAP和rhIFN-α2b均得到正确表达;酶活性检测结果表明reMAP具有水解N端甲硫氨酸的活性,切除MET的活性>30 pmol/(μg.min);两种方法作用后的rhIFN-α2b经氨基酸序列测定后显示N端起始甲硫氨酸均被切除,其中体内作用切除率>94%、体外作用切除率>96%。结论 reMAP可以用于rhIFN-α2b N末端的初始甲硫氨酸的切除。
- 王中安宋礼华
- 关键词：基因表达大肠杆菌
- 不同接头的白蛋白干扰素在毕赤酵母中表达的研究被引量：3
- 2012年
- 毕赤酵母作为比较成熟的真核表达系统[1],它具有许多优点,表达产物直接分泌到胞外,这有利于产物的分离纯化。白蛋白干扰素在毕赤酵母中表达的研究也具有很重要的意义。研究白蛋白与干扰素之间的接头蛋白不同对表达量的影响。通过重叠PCR构建不同接头的白蛋白干扰素重组子,然后分别用salⅠ酶切线性化,通过电转仪转入毕赤酵母SMD1168,在MD板上进行培养,分别挑取10个克隆进行甲醇诱导表达,筛选出表达量最高的一个。最后在相同的条件下,分别将表达量高的进行诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE鉴定,由于表达产物中有杂蛋白,通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定融合白蛋白干扰素的表达量,由已知浓度的白蛋白干扰素标准曲线,可以计算出不同接头的白蛋白干扰素的表达量,这对工业化生产具有指导意义。
- 刘磊范清林王中安张玲邹文艺宋礼华
- 关键词：毕赤酵母
- 利用大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶去除重组人干扰素-α2b N端的起始甲硫氨酸
- 摘要目的获取大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶（reMAP）基因，构建重组大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶的原核高表达载体pACYCDuet-1-MAP，利用大肠杆菌BL21作为宿主菌进行原核表达，并利用表达的reMAP切除重组人干扰素-...
- 王中安
- 关键词：干扰素-Α2B基因表达大肠杆菌
- 文献传递
