刘江
- 作品数：2 被引量：14H指数：2
- 供职机构：厦门大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：福建省科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 荧光定量PCR检测异尖线虫类病原体被引量：12
- 2010年
- 目的运用荧光定量PCR法检测异尖线虫类病原体。方法于鱼类内脏中检获6种异尖线虫类幼虫:抹香鲸异尖线虫、简单异尖线虫、内弯对盲囊线虫、带鱼针蛔线虫、灰海鳗对盲囊线虫和台湾海峡鱼类中一优势种对盲囊线虫。提取各虫体DNA,PCR扩增ITS-2序列,测序并进行数据库比对。依据测序结果设计特异引物,常规PCR检验引物特异性。将ITS-2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性和重复性试验。结果构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数均在0.998以上。重复性实验中,6种虫体对应的变异系数(cv)最小值为0.18%,最大值为2.80%,试验间平均cv最小值为0.55%,最大值为1.94%,无非特异性扩增,溶解曲线的特异性和重复性良好。灵敏度实验中,可检出的最低模板浓度为1×102拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍。结论初步建立了SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测异尖线虫类病原体的方法 。
- 张少雷王何兰刘江倪芳徐世三罗大民
- 关键词：荧光定量PCR
- 简单异尖线虫L-样半胱氨酸蛋白酶基因的克隆与表达被引量：2
- 2010年
- 目的克隆简单异尖线虫L-样半胱氨酸蛋白酶基因(AsCP)全长,研究其表达特性。方法根据GenBank中简单异尖线虫表达序列标签L-样半胱氨酸蛋白酶基因的部分信息,设计特异引物,用cDNA末端快速扩增技术扩增3′端部分,获得基因全长序列。根据基因全长序列设计引物,以简单异尖线虫总RNA为模板,RT-PCR扩增AsCP基因编码序列,产物经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,克隆至表达载体pET32а(+),转化大肠埃希菌BL21(DE3)株,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达效果经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测。结果3′端扩增片段大小为1211bp,拼接完整后基因全长1462bp,编码411个氨基酸,与秀丽隐杆线虫的L-半胱氨酸蛋白酶相似性达36.4%;重组载体pET32a(+)-AsCP经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后有一条约1150bp的条带,测序结果显示重组载体构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白相对分子质量约为Mr60000(含6个组氨酸的标签),与目的蛋白相符。用不同浓度的IPTG诱导对表达量的影响很小,1mmol/LIPTG诱导2h后表达量达到最高水平。结论成功克隆并表达了L-样半胱氨酸蛋白酶。
- 徐世三倪芳张少雷刘江罗大民
- 关键词：简单异尖线虫克隆原核表达
