张少雷
- 作品数：3 被引量：15H指数：2
- 供职机构：厦门大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：福建省科技计划项目厦门市科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 荧光定量PCR检测异尖线虫类病原体被引量：12
- 2010年
- 目的运用荧光定量PCR法检测异尖线虫类病原体。方法于鱼类内脏中检获6种异尖线虫类幼虫:抹香鲸异尖线虫、简单异尖线虫、内弯对盲囊线虫、带鱼针蛔线虫、灰海鳗对盲囊线虫和台湾海峡鱼类中一优势种对盲囊线虫。提取各虫体DNA,PCR扩增ITS-2序列,测序并进行数据库比对。依据测序结果设计特异引物,常规PCR检验引物特异性。将ITS-2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性和重复性试验。结果构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数均在0.998以上。重复性实验中,6种虫体对应的变异系数(cv)最小值为0.18%,最大值为2.80%,试验间平均cv最小值为0.55%,最大值为1.94%,无非特异性扩增,溶解曲线的特异性和重复性良好。灵敏度实验中,可检出的最低模板浓度为1×102拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍。结论初步建立了SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测异尖线虫类病原体的方法 。
- 张少雷王何兰刘江倪芳徐世三罗大民
- 关键词：荧光定量PCR
- 简单异尖线虫L-样半胱氨酸蛋白酶基因的克隆与表达被引量：2
- 2010年
- 目的克隆简单异尖线虫L-样半胱氨酸蛋白酶基因(AsCP)全长,研究其表达特性。方法根据GenBank中简单异尖线虫表达序列标签L-样半胱氨酸蛋白酶基因的部分信息,设计特异引物,用cDNA末端快速扩增技术扩增3′端部分,获得基因全长序列。根据基因全长序列设计引物,以简单异尖线虫总RNA为模板,RT-PCR扩增AsCP基因编码序列,产物经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,克隆至表达载体pET32а(+),转化大肠埃希菌BL21(DE3)株,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达效果经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测。结果3′端扩增片段大小为1211bp,拼接完整后基因全长1462bp,编码411个氨基酸,与秀丽隐杆线虫的L-半胱氨酸蛋白酶相似性达36.4%;重组载体pET32a(+)-AsCP经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后有一条约1150bp的条带,测序结果显示重组载体构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白相对分子质量约为Mr60000(含6个组氨酸的标签),与目的蛋白相符。用不同浓度的IPTG诱导对表达量的影响很小,1mmol/LIPTG诱导2h后表达量达到最高水平。结论成功克隆并表达了L-样半胱氨酸蛋白酶。
- 徐世三倪芳张少雷刘江罗大民
- 关键词：简单异尖线虫克隆原核表达
- 台湾海峡异尖线虫病病原线虫幼虫的rDNA序列分析被引量：1
- 2009年
- 目的分析台湾海峡异尖线虫病潜在病原线虫的rDNA序列,为建立病原分子生物学鉴别提供依据。方法剖检台湾海峡常见鱼类的寄生线虫幼虫,镜检分类。提取虫体DNA、用通用引物对rDNA进行PCR扩增、克隆、双向测序及BLAST比对。结果获得6条来自6种线虫幼虫的rDNA序列,其中的3种在GenBank数据库中没有发现匹配的序列;证实在台湾海峡分布的灰海鳗对盲囊线虫成虫和疑似其第三期幼虫实属同种;构建了基于ITS-2的序列间内部相似性程度关系树。结论异尖线虫病原幼虫所具有的分子生物学鉴别信息位点主要集中在ITS-2间隔区。
- 张少雷徐世三罗大民
- 关键词：RDNA
