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幽门螺杆菌多靶点疫苗工程菌BIB发酵及纯化工艺研究被引量：1: 2014年; 目的初步建立重组幽门螺杆菌多靶点疫苗工程菌（BIB）的高密度发酵及其蛋白纯化工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,放大工艺至50L发酵罐中,对影响目的蛋白收率的因素如发酵培养基、工作种子接种量、诱导剂浓度、诱导起始时间、诱导持续时间及诱导剂添加方式等进行优化验证;并利用rBIB蛋白高等电点特性（pI=9.05）,在pH 7.0-7.5的磷酸盐缓冲液中目的蛋白带正电荷,采用阳离子交换层析进行纯化,对阳离子交换层析填料及纯化缓冲液的pH进行优化。结果经高密度发酵后BIB菌体产量为70g/L,蛋白表达量为32%;rBIB蛋白经阳离子交换层析纯化后其纯度为91.8%。结论该工艺的初步建立为深入研究rBIB蛋白性质及其规模化生产奠定了基础。; 潘兴王保宁杨靖李健春祝捷周永君王红仁李明远李婉宜; 关键词：幽门螺杆菌疫苗高密度发酵尿素酶B亚单位

Ag85A-HA2原核表达载体的构建及其抗甲型流感病毒免疫效果的研究: 2014年; 目的构建结核杆菌分泌型抗原85A(Ag85A)与流感病毒血凝素(HA)中HA2(Ag85A-HA2)原核表达载体,并表达融合蛋白,研究其抗流感病毒的免疫保护效果。方法构建Ag85A-HA2原核表达载体pET-32a(+)/Ag85A-HA2;异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达Ag85A-HA2融合蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,并使用吸附多聚组氨酸标签(His-Tag)的蛋白纯化柱分离纯化蛋白;甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)攻击重组蛋白免疫后的BALB/c小鼠(并设PBS对照组),通过观察小鼠肺病理切片、测定肺指数及肺指数抑制率、死亡保护率等指标分析其免疫保护效果。结果成功构建了原核表达载体pET-32a(+)/Ag85A-HA2;SDS-PAGE电泳分析显示成功表达相对分子质量为70×103的重组融合蛋白;动物实验表明,融合蛋白Ag85A-HA2对IAV攻击后的小鼠肺指数抑制率达到39.30%,死亡保护率达到80%,效果明显高于PBS对照组(P<0.05),肺部病理切片也证实融合蛋白Ag85A-HA2对小鼠肺部的保护效果显著。结论成功构建了Ag85A-HA2原核表达载体并表达出融合蛋白,该融合蛋白在动物体内能发挥良好的抗甲型流感病毒感染的免疫保护效果。; 邵京京杨靖戴军孟俊杰裴德翠李虹潘兴李婉宜; 关键词：甲型流感病毒流感病毒血凝素免疫效果

流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg的构建与细胞转染研究: 2015年; 目的设计并构建含分子内佐剂的流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg,初步研究其在HEK293T细胞中的转染效率。方法通过生物信息学软件设计并合成了含分子内佐剂的流感病毒多表位基因CTB-Eg,将其插入真核载体pEGFP-C2中,获得了重组质粒pEGFP-C2/CTB-Eg;用脂质体法转染HEK293T细胞,通过荧光显微镜观察和PCR法检测其转染效率。结果成功构建了真核表达质粒pEGFP-C2/CTB-Eg,且该重组质粒能在HEK293T细胞中瞬时转染,转染效率在50%～70%之间。结论本研究成功设计、构建了CTB-Eg融合基因,其在HEK293T细胞中转染效率较高,为流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg在小鼠体内的抗病毒作用研究奠定了坚实基础。; 寇静远潘兴李婉宜邝玉周琳琳杨靖石新丽陆顺顺黄筱钧邓昭敏秦臻王保宁李明远; 关键词：流感病毒多表位基因霍乱毒素B亚单位

两株抗幽门螺杆菌特异性卵黄抗体的制备及性能被引量：2: 2015年; 目的分别制备抗幽门螺杆菌(H.pylori)全菌(SS1株)和尿素酶I和尿素酶B的重组蛋白(r IB)的特异性卵黄抗体(Ig Y),纯化后研究其体外抑菌效果。方法分别以超声破碎SS1菌液和r IB为抗原免疫来杭鸡,用水稀释法和硫酸铵沉淀法纯化获得相应特异性Ig Y(SS1-Ig Y、IB-Ig Y)。将特异性Ig Y与SS1混合作用后共培养检测其抑菌效果,快速脲酶试验检测其抗尿素酶作用。结果成功制备2种特异性Ig Y:SS1-Ig Y和IB-Ig Y,效价超过1∶12 800,纯度超过80%。SS1-Ig Y和IB-Ig Y均有体外抗尿素酶活性和抑菌作用。结论 SS1-Ig Y和IB-Ig Y均具有在体外抑制H.pylori尿素酶活性和抑制H.pylori生长的作用。; 杨廷敏杨靖王保宁潘兴李建春祝捷周永君李明远曹随忠; 关键词：幽门螺杆菌卵黄抗体来杭鸡尿素酶

幽门螺杆菌BIB原核表达工程菌的构建及微生物学特性分析被引量：4: 2013年; 目的构建融合了幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白(Ure I)、尿素酶B亚单位(Ure B)的表位基因及霍乱毒素B亚单位(CTB)的原核表达质粒pET28a(+)/ct B/ure I-B(简称BIB)及其原核表达工程菌,并研究其生物学特性。方法参考基因库中ure I、ure B、ct B的基因序列,合成不含信号肽的ct B基因及ure I、ure B优势表位基因,串联融合,形成多靶点重组ct B/ure I-B基因(简称BIB基因),并构建pET28a(+)/BIB原核表达质粒,经限制性内切酶Nco I、Xho I酶切以及DNA测序鉴定正确后,将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建含BIB基因的原核表达工程菌。经乳糖诱导后,SDS-PAGE电泳检测重组蛋白(rBIB),Western blot及肌注BALB/c小鼠实验检测rBIB的免疫反应性和免疫原型。结果构建的原核表达质粒pET28a(+)/BIB,经双酶切和测序分析显示,构建的BIB基因与设计序列100%一致。乳糖诱导后,SDS-PAGE电泳显示在33kD左右出现一条明显蛋白条带,Western blot检测在33kD左右出现特异反应条带,肌注免疫BALB/c小鼠产生了较高的抗体水平。结论成功构建了pET28a(+)/BIB原核表达质粒及BIB原核表达工程菌,该工程菌可表达重组蛋白rBIB,且该重组蛋白具有良好的免疫反应性及免疫原性。; 潘兴肖继红杨靖王保宁李健春周法庭祝捷周永君李婉宜李明远; 关键词：幽门螺杆菌 URE CTB

幽门螺杆菌多表位重组原核表达工程菌的构建及表达特性研究被引量：4: 2014年; 目的构建含有幽门螺杆菌尿素酶(UreI、UreB)及粘附素(HpaA)的多表位原核表达质粒pET28a(+)/ureI-ureB-hpaA〔pET28a(+)/IBA〕及相应的原核表达工程菌,研究其表达特性。方法通过生物信息学方法从ureI、ureB和hpaA基因中筛选T细胞和B细胞优势表位基因序列,人工合成并构建原核重组表达质粒pET28a(+)/IBA。经限制性内切酶(NdeⅠ,XhoⅠ)酶切鉴定及DNA测序鉴定后导入大肠杆菌BL21(DE3)。该工程菌经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测重组蛋白(rIBA)的表达情况,以抗幽门螺杆菌悉尼株(SS1株)特异卵黄抗体采用Western blot检测rIBA的抗原性。结果构建的多表位原核表达质粒pET28a(+)/IBA双酶切和测序鉴定与设计序列100%一致。工程菌经IPTG诱导后SDS-PAGE电泳显示在相对分子质量40×103左右有一条明显蛋白条带,Western blot显示有相应位置特异反应条带。结论成功构建幽门螺杆菌多表位重组原核表达质粒pET28a(+)/IBA及相应原核表达工程菌,该工程菌表达的rIBA具有抗原性,表明该重组蛋白与幽门螺杆菌有高度相关性。; 丁娜娜杨靖潘兴周永君李建春祝捷王保宁李明远; 关键词：幽门螺杆菌表位尿素酶粘附素工程菌

重组幽门螺杆菌多表位疫苗工程菌株的构建及其微生物学特性研究被引量：4: 2015年; 目的构建含有幽门螺杆菌尿素酶(ureI、ureB)及霍乱毒素B亚单位(ctB)融合片段的多表位疫苗工程菌,并研究其微生物学特性。方法通过生物信息学方法从ureI和ureB基因中筛选出T细胞和B细胞优势表位,通过柔性Linker相连,并在其N端加入分子内佐剂序列ctB,按照大肠杆菌BL21(DE3)的密码子偏好性进行密码子优化,即为BIB序列。人工合成之后,插入原核表达质粒pET28a(+)中,构建pET28a(+)/ctB-ureI-ureB〔pET28a(+)/BIB〕重组质粒。经限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序鉴定正确后,将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。BIB工程菌经乳糖诱导表达后,SDS-PAGE检测重组蛋白BIB的表达情况,并对其N端氨基酸序列和相对分子质量进行测定,Western blot对其进行抗原性鉴定。结果原核表达质粒pET28a(+)/BIB经双酶切和测序鉴定构建正确,SDS-PAGE电泳显示在相对分子质量33×103处有一条明显条带,其N端氨基酸序列和相对分子质量与设计序列100%一致,Western blot结果显示BIB可以与抗幽门螺杆菌悉尼株(SS1株)小鼠血清及鼠抗CTB单抗产生特异性反应。结论成功构建了幽门螺杆菌多表位重组原核表达工程菌,该工程菌表达的BIB蛋白抗原性良好。; 王保宁潘兴黄筱钧周永君祝捷高礼珍牛晓娟李婉宜李明远王红仁; 关键词：多表位疫苗尿素酶B亚单位霍乱毒素B亚单位

幽门螺杆菌双基因多表位重组原核表达工程菌的构建及其表达特性的研究被引量：3: 2013年; 目的构建含幽门螺杆菌尿素酶保守基因序列ureI和ureB的双基因(简称IB)多表位原核表达质粒以及原核表达工程菌,并研究其微生物学特性。方法通过生物信息学方法从ureI和ureB基因中筛选T细胞和B细胞优势表位基因序列,人工合成所选择的表位基因序列并构建原核重组表达质粒pET28a(+)/IB。经限制性内切酶(EcoR I,Xho I)鉴定及DNA测序鉴定后,将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)。该工程菌经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测重组蛋白(rIB)的表达情况,用Western blot检测rIB的免疫反应性。结果构建的双基因多表位基因序列与所设计的一致;工程菌经IPTG诱导后做SDS-PAGE电泳显示,在28kD左右有一条明显蛋白条带,Western blot结果显示在28kD左右出现特异反应条带。结论成功构建含ureI和ureB双基因序列的原核表达质粒pET28a(+)/IB及工程菌,该工程菌表达的重组蛋白rIB能被抗幽门螺杆菌悉尼株(H.pylori SS1)的特异抗体所识别,表明该新重组蛋白与幽门螺杆菌有高度相关性。; 杨靖潘兴欧琴周法庭李建春祝捷周永君李明远王保宁; 关键词：幽门螺杆菌多表位原核表达

重组小鼠β-防御素2体外抗不可分型流感嗜血杆菌活性的研究: 目的:在原核系统中表达并纯化重组MBD2融合蛋白,并对其体外抗NTHi的活性进行初步研究。方法:利用本实验室已经构建好的原核表达质粒pET32-mBD2,在优化的表达条件下诱导重组质粒高效表达;采用亲和层析法对目的蛋白进...; 潘兴姚锋陆顺顺孟俊杰桑云璐李婉宜; 关键词：不可分型流感嗜血杆菌抗菌活性; 文献传递

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