郑娴娴
- 作品数：8 被引量：7H指数：1
- 供职机构：安徽医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金教育部留学回国人员科研启动基金北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 抗呼吸道合胞病毒融合蛋白单链抗体的筛选及初步鉴定
- 2009年
- 目的:从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗呼吸道合胞病毒F蛋白的单链抗体。方法:以RSV F蛋白为靶抗原,通过"吸附-洗涤-洗脱-扩增"过程从天然人源性噬菌体抗体库中筛选特异性抗F蛋白单链抗体。5轮筛选后,单克隆经ELISA检测,阳性克隆进行核酸序列分析,并将阳性克隆噬菌体感染E.coliHB2151,经IPTG诱导,制备抗RSV F蛋白的可溶性单链抗体,并进行Western blot及Dot blot分析。结果:经过筛选,获得了18株能与F蛋白特异性结合的阳性克隆,取OD值最高的克隆E4经测序并检索Kabat数据库分析,显示其基因与人免疫球蛋白可变区基因具有高度同源性,Western blot及Dot blot分析表明为单链抗体。结论:利用天然人源性噬菌体抗体库技术制备出高特异性的人源性抗RSV F蛋白单链抗体。
- 魏薇包福祥何金生付远辉王小波郑娴娴张莹
- 关键词：人呼吸道合胞病毒F蛋白噬菌体抗体库单链抗体
- 呼吸道合胞病毒感染滴度测定方法的建立与比较被引量：1
- 2010年
- 目的建立稳定的呼吸道合胞病毒（RSV）感染滴度测定的实时荧光定量PCR（Realtime Quantitative PCR，Q-PCR）检测方法和酶免疫斑点法（Enzyme Immunospots，EIS），并与半数定量方法（50％tissue culture infectious doses，TCID50）进行比较。方法分别采用Q-PCR、EIS和TCID50分析RSV感染的细胞和RSV攻毒后小鼠肺脏标本中的病毒滴度。结果RSV感染细胞的上清中，三种分析方法检测的病毒滴度值之比为：Q—PCR和EIS（pfu）的比约为10：1，EIS（pfu）和TCID50（TCID50换算成pfu）比约为10：1；RSV攻毒后小鼠肺脏标本中，三种分析方法检测的病毒滴度值之比为，Q—PCR和EIS（pfu）比约为1000：1，EIS（pfu）和TCID50（TCID50换算成pfu）比约为5：1。结论成功建立了RSV感染滴度测定的Q-PCR和EIS分析方法，通过与TCID50方法的比较分析，我们认为EIS法分析RSV滴度具有成本低和较高的灵敏度，有较好的应用前景。
- 王小波何金生付远辉郑娴娴方璇
- 关键词：呼吸道合胞病毒滴定分析法聚合酶链反应半数抑制浓度
- 辅助病毒依赖型腺病毒载体转基因的体外表达效率
- 目的辅助病毒依赖型腺病毒载体/(Helper-dependent adenoviral vector, HDAd/)主要用于基因治疗的研究,目前仅有两篇关于HDAd作为系统疫苗载体的研究报道,与第一代腺病毒载体或复制缺陷...
- 郑娴娴
- 关键词：增强型绿色荧光蛋白转基因表达
- 文献传递
- 呼吸道合胞病毒分泌型融合蛋白的真核表达和纯化
- 2009年
- 目的研究人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial viruse，RSV）分泌型融合蛋白（secreted fusion protein，sV）基因在杆状病毒中的表达及纯化。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物，以PCR方法将F蛋白基因的跨膜区和胞质区核酸序列替换为6×His核酸序列，获得COOH’端带有His标签的重组SF-His蛋白编码基因，利用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统，构建可表达sF蛋白的重组杆状病毒，用脂质体Cellfeetine reagent转染sf9细胞，实现sF在sf9细胞中的表达，Ni柱亲和层析纯化sF蛋白。结果成功获得了sF-His编码基因，构建的重组杆状病毒可高效表达sF，Ni-柱纯化后sF的浓度为1．084mg／ml，纯度达90％以上。结论杆状病毒系统是制备sF的有效方法，纯化的sF蛋白为RSV新型疫苗及单克隆抗体和诊断试剂等研究奠定了基础。
- 付远辉魏薇何金生郑娴娴王小波唐倩张梅屈建国洪涛
- 关键词：糖蛋白类
- 增强型绿色荧光蛋白的真核表达和纯化被引量：1
- 2011年
- 根据编码增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的开放读码框(open reading frame,ORF)设计引物,PCR方法扩增出5'端带His标签的EGF PORF,利用杆状病毒表达系统构建表达EGFP基因的重组杆状病毒DNA分子,转染sf9细胞。取细胞培养上清进一步感染sf9细胞,荧光显微镜下观察EGFP蛋白的表达,Ni柱亲和层析纯化表达的EGFP蛋白,并将纯化后的EGFP用于EGFP特异性体液分析。结果显示成功克隆了EGF PORF,荧光显微镜观察到重组杆状病毒表达的EGFP,Ni柱亲和层析可获得纯度达90%的EGFP蛋白,纯化后的EGFP蛋白仍然具有良好的免疫原性,能作为包被抗原分析体液免疫效果。利用杆状病毒表达系统制备EGFP,具有产量高、纯化方便及生物活性好的特点。
- 张梅付远辉何金生陆燕燕郑娴娴
- 关键词：基因克隆增强型绿色荧光蛋白昆虫杆状病毒表达系统
- 人呼吸道合胞病毒微型复制子的构建被引量：1
- 2009年
- 【目的】构建RSV微型复制子(minireplicon)并进行功能学研究。【方法】构建含RSV病毒前导序列(Leader,genomic promoter,Le)、转录起始信号(gene start,GS)、多克隆酶切位点、转录终止信号(gene end,GE)和尾随序列(Trailer,antigenomic promoter,Tr)的基因片段GSGE,通过引入T7RNA多聚酶(T7RNApolymerase,T7RNP)启动子、克隆入载体px8δT和插入增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)等多步操作,获得RSV微型复制子重组质粒px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP。同时构建可表达大蛋白(large protein,L)的质粒pcDNA3.1/L及表达转录延长/转录终止抑制因子(M2ORF1protein,M2-1)的质粒pcDNA3.1/M2-1。通过脂质体法共转染RSV微型复制子质粒及四种RSV核壳体蛋白质粒至可表达T7RNP的BSRT7/5细胞系,倒置荧光显微镜及流式细胞仪分析EGFP的表达情况。【结果】成功构建了px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP及pcDNA3.1/L和pcDNA3.1/M2-1,五质粒共转染BSR T7/5细胞,倒置荧光显微镜及流式细胞仪均观察到绿色荧光的表达。【结论】构建的RSV微型复制子具有转录和复制功能,将有助于进一步开展以RSV反向遗传操作为基础的RSV疫苗研发及药物筛选。
- 唐倩虞结梅何金生张梅魏薇付远辉郑娴娴王小波张莹洪涛
- 关键词：人呼吸道合胞病毒增强型绿色荧光蛋白
- 真核表达人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法被引量：3
- 2008年
- 目的真核表达人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F),并完成蛋白纯化及纯度测定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物,PCR方法扩增出3′端带His标签的F基因序列,克隆入pGEM-T-easy载体,经核酸序列分析后,进一步克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体,限制性内切酶鉴定,用脂质体Lipofectamine 2000转染COS-7细胞,72h后再用Western blot检测目的蛋白的表达。Ni柱亲和层析纯化COS-7细胞表达的F蛋白,高效毛细管电泳分析纯化后蛋白纯度。结果核酸序列分析证实获得带His标签的RSVF基因序列,没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,利用Western blot方法检测到F蛋白的特异性条带,纯度达99%以上。结论初步建立了真核表达RSVF蛋白的纯化方法,为进一步优化RSVF蛋白制备条件及单克隆抗体及诊断试剂等研究奠定了基础。
- 陆燕燕何金生张梅虞结梅谢灿袁媛薛绍礼宋蔚郑娴娴
- 关键词：人呼吸道合胞病毒F基因真核表达纯化
- 辅助病毒依赖型腺病毒载体转基因的体外表达效率被引量：1
- 2010年
- 构建可表达增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(Helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和体外表达鉴定。荧光显微镜证实HDAd/EGFP可表达,电镜下观察到经CsCl纯化后的腺病毒的典型形态。分光光度计法测定病毒的浓度为4.0×1012颗粒数(Virus particle,vp)/mL。与可表达EGFP的第一代腺病毒载体(First generation adenoviral vector,FGAd)FGAd/EGFP进行了体外感染和转基因表达效率的比较研究,分别用约2000vp/细胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549细胞,流式细胞仪检测EGFP的表达情况。通过相同时间点流式细胞仪分析EGFP的表达情况,可见HDAd/EGFP感染早期的A549细胞较FGAd/EGFP有更高的荧光表达率及更高的表达强度,显示HDAd载体具有转基因瞬时高表达的特性,是一种更有价值的疫苗载体。
- 郑娴娴何金生付远辉徐少华谢灿石长信张梅王小波洪涛
- 关键词：增强型绿色荧光蛋白转基因表达
