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高纯度诊断用重组甘油激酶的制备和鉴定: 2013年; 用乳糖诱导重组甘油激酶(r-GK)在E.coli中高效表达,经300L发酵罐发酵培养,建立了高效、低成本的r-GK发酵生产工艺。发酵菌体终密度OD600值达到42,r-GK表达量占菌体可溶性蛋白的30%左右。菌体破碎液经选择性热变性处理,Ni Sepharose FF层析二步纯化,产物纯度大于97%。经梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(GradientPAGE)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,r-GK分子量为120kDa,由分子量相同的2个亚基组成。甘油激酶中2种NADH氧化酶和过氧化氢酶干扰酶未被检出。保存稳定性实验表明纯化后酶液在4℃条件下保存30d可保留约85%的活性,而冻干粉剂在4℃条件下保存1年活性仍可保留93%以上。; 孟尧王振伟王帅坤郝杰清师慧孟延发刘双凤; 关键词：乳糖高密度发酵

毕赤酵母表达重组葡萄糖氧化酶的发酵条件被引量：3: 2013年; 对甲醇诱导重组Pichia pastorisGS115 mut+高效表达黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的条件进行了研究,拟建立一条高效低成本的生产重组葡萄糖氧化酶的工艺路线。通过摇瓶试验对发酵培养基、诱导时机、pH、诱导温度、甲醇诱导浓度等进行了优化,随后进行了50 L发酵罐扩大化培养。结果表明,最适发酵培养基为YEPD培养基,甲醇诱导产酶的最佳时机为菌体对数生长末期,最佳诱导浓度为1%,最适诱导pH范围为6-6.5,最适诱导温度25℃。按优化的条件用50 L发酵罐分批培养酵母14 h,甲醇诱导培养48 h后生物量和酶活性达到最高。菌体终密度达到OD600为44,每升发酵液中产酶105 kU,发酵液上清蛋白含量为1 000 mg/L。; 王帅坤郝杰清王振伟师慧孟延发; 关键词：葡萄糖氧化酶毕赤酵母高密度发酵

黑曲霉脂肪酶的分离纯化及酶学性质的研究被引量：1: 2014年; 目的以黑曲霉发酵液为原料，分离纯化脂肪酶，并研究其酶学性质。方法以硫酸铵沉淀、Q—SepharoseFastFlow和SephacrylS-200凝胶层析等方法分离纯化脂肪酶，利用SDS—PAGE、PAGE、IEF—PAGE等方法进行鉴定。结果所得脂肪酶为单一条带，等电点为3．2，天然分子质量为43．7kDa。以P—NPP为底物，在pH6、50℃条件下，K。=15．67mmol·L^-1；脂肪酶对多种油脂均有水解作用；此酶在65℃以下，pH3—12稳定，在50℃、pH4表现出相对高的酶活性；Ca^2＋、Co^2＋、Mn^2＋、Ni^2＋、卵磷脂、胆酸钠对脂肪酶活性有激活作用，Hg^2＋有抑制作用；PMSF对此脂肪酶有特异性修饰作用。结论确定了黑曲霉脂肪酶的部分酶学性质，为脂肪酶的应用提供了理论依据。; 师慧孟尧范翔李刚锐孟延发; 关键词：黑曲霉脂肪酶分离纯化

皱褶假丝酵母脂蛋白脂酶的分离纯化及酶学性质的研究: 2012年; 目的从皱褶假丝酵母的发酵液中纯化脂蛋白脂酶,并对其酶学性质进行研究。方法利用硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow和Phenyl Sepharose CL-4B层析等方法进行纯化,利用SDS-PAGE、PAGE和HPLC法进行鉴定。结果获得的脂蛋白脂酶为单一组分,相对分子质量为34 kDa;此酶在50℃、pH6～9时保持稳定;在最适条件下测得其米氏常数(Km)为3.4×10-4mol·L-1;用等电点沉淀法测得脂蛋白脂酶的pI=5.5;Hg+、Cu2+、Ag+和SDS是脂蛋白脂酶的抑制剂,Mg2+和Triton X-100对此酶有激活作用。结论文中方法获得了皱褶假丝酵母脂蛋白脂酶的酶学性质,对此酶在食品、医药和生物技术等领域的应用提供了理论支持。; 王殊睿刘双凤师慧王帅坤王振伟郝杰清孟延发; 关键词：脂蛋白脂酶

重组尿酸酶发酵培养及制备的工艺条件被引量：2: 2015年; 利用含PET-Urate Oxidase表达质粒的重组E.coli JM109（DE3）菌株进行大规模发酵培养,拟建立一种高效、低成本的生产重组尿酸酶的技术工艺路线。取冻存的工程菌接种于含质量分数1%琼脂的种子培养基中进行培养,从划线平板上挑取单菌落接种于摇瓶中继续培养,最后以体积分数5%接种量接种于发酵培养基中,绘制生长曲线;以乳糖作为诱导剂与传统IPTG诱导方法进行发酵培养比较;菌体经高压均质机破碎、质量分数40%-60%硫酸铵分级沉淀,以及Q-Sepharose F.F.层析进行分离纯化。结果显示,乳糖作为诱导剂在300 L的发酵罐中进行培养可获得菌体湿质量2 700 g,目的蛋白质表达量占菌体可溶性蛋白质的30%左右,略高于IPTG诱导的效果;经分离纯化后该酶的纯化倍数可达原来的4.5倍,活性回收率为40%;纯化的重组尿酸酶经SDS-PAGE和HPLC分析,显示单一蛋白质色带和单一洗脱峰。成果为该酶的医学实际应用奠定了理论实验基础。; 赵明何中杰王瑞姚明东师慧王振伟孟尧; 关键词：乳糖发酵纯化

重组毕赤酵母葡萄糖氧化酶的纯化和性质被引量：7: 2013年; 目的:探讨重组毕赤酵母葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)的分离纯化过程及其性质。方法:摇瓶发酵得到的粗酶液经Q-Sepharose Fast Flow层析纯化,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定其分子质量,用紫外和荧光分光光度计研究其光谱特征。结果:获得GOD的纯品,酶的纯化倍数为1.35倍,酶活回收率为92.7%,天然分子质量为150kD,亚基分子质量为75kD;酶活力在pH5.0～8.0和55℃以下稳定,最适pH值为6.0,最适温度为40℃;以葡萄糖为底物的酶学动力学常数Km值为21.06mmol/L;Hg2+、Ag+、Cu2+、Fe2+对其有强烈的抑制作用;该酶在275nm波长处有最大紫外光吸收,在344nm波长处有最大荧光吸收峰;液体状态下该酶在4℃条件下放置6个月活性没有损失,常温下可保存3～5d。结论:重组毕赤酵母葡萄糖氧化酶纯化成本低,收率高,有利于大规模纯化,得到的纯品稳定性好,具有较高的利用价值。; 郝杰清王帅坤师慧王振伟孟延发; 关键词：毕赤酵母葡萄糖氧化酶纯化

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师慧