王净
- 作品数：9 被引量：23H指数：3
- 供职机构：第四军医大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人源性抗乳腺癌单链抗体库的筛选与初步鉴定被引量：4
- 2012年
- 目的:本研究旨在已构建的大容量人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的基础上,筛选出高亲和力的特异性单链抗体(scFv)并对抗体基本特性进行初步鉴定。方法:以人乳腺癌细胞系MCF-7为靶标,经过4轮淘洗,筛选出高亲和力的特异性抗乳腺癌scFv,并对其结构序列进行分析;通过ELISA和Western blot方法,鉴定scFv的亲和力和特异性,以及其蛋白的基本表达情况。结果:成功构建具有高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库,获得scFv的长度约为750 bp,ELISA证实所得抗体对乳腺癌细胞具有良好的亲和力和高度的特异性,IPTG诱导表达及Western blot结果显示,scFv为相对分子质量(Mr)30 000的可溶性蛋白。结论:本研究在已构建的大容量抗乳腺癌单链抗体库的基础上,筛选获得了高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库。研究结果为进一步获得可应用于临床诊断和治疗的乳腺癌靶向性抗体奠定了良好的基础。
- 王净王慧王超袁媛崔岩叶菁李青
- 关键词：单链抗体乳腺癌人源性噬菌体抗体库
- 细胞培养常见问题分析及防控措施被引量：2
- 2011年
- 细胞培养技术广泛用于科研、教学及临床研究实验，已经成为当今生命科学各研究领域的基本技术，也是医学研究生必备的实验技能。本文就细胞培养过程中一些常见的问题及应对措施进行了阐述。
- 张秀敏郭风王净袁媛
- 关键词：细胞培养无菌操作污染
- 人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的构建、筛选与初步鉴定
- 研究背景：
乳腺癌是当代女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率约占女性各种恶性肿瘤的7/%~10/%，全世界每年约有50万人因此死亡。除了手术治疗，目前乳腺癌的治疗手段主要还包括放疗、化疗、内分泌治疗等。赫赛汀是历史上...
- 王净
- 关键词：单链抗体乳腺癌人源性噬菌体抗体库
- 文献传递
- 人肝癌靶向性CD80基因表达重组腺病毒载体的构建及鉴定被引量：1
- 2010年
- 目的:构建人肝癌靶向性CD80基因重组腺病毒载体。方法:首先,从人基因组DNA中克隆AFP增强子、启动子,利用腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShutte-CMV,采用AFP增强子替换CMV启动子,构建含有AFP启动子和增强子的穿梭质粒,命名为pShuttle-AFP。将人CD80基因克隆到pShuttle-AFP的AFP增强子和启动子之后,构建pShuttle-AFP-CD80质粒。再将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coliBJ5183,利用同源重组构建腺病毒质粒pAd-AFP-CD80。以获得的重组子转染AD293细胞后制备重组腺病毒,并对重组的病毒进行鉴定和病毒滴度测定。结果:测序结果与Genebank中公布的AFP启动子、核心增强子和CD80基因序列相符。双酶切结果与预期结果相符。PacI酶切结果与目的结果一致。穿梭质粒pShutte-AFP-CD80和腺病毒质粒pAd-AFP-CD80经酶切和PCR鉴定均获得期望大小的目的片段。结论:成功的构建了人肝癌靶向性pAd-AFP-CD80腺病毒载体,为CD80基因在肝癌靶向性治疗的研究奠定了基础。
- 温银田张丙芳叶菁吴雅岚王净李勇
- 关键词：肝癌靶向治疗CD80腺病毒
- 全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的构建被引量：2
- 2011年
- 目的:利用噬菌体展示技术构建全人源性抗乳腺癌单链抗体库。方法:从临床获取未化疗乳腺癌病人外周血样30份,分离出单个核细胞(PBMC),提取总RNA,用RT-PCR技术逆转录获得cDNA,并扩增出全套人抗体重链(VH)和轻链(VL)基因,经重叠延伸PCR(SOE-PCR),在体外将两者连接成单链抗体(scFv)基因片段,将该片段用Sfi I和Not I酶切后克隆至pCantab5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,收集培养后平板上的菌落,即构建初级噬菌体单链抗体库。结果:得到长度约为360bp和340bp的VH和VL,拼接后得到的scFv长度约为750bp;经PCR初步鉴定插入率约为80%,BstN 1多样性酶切检验,酶切图谱呈多样性。经测序验证,最终获得库容约为2.4×106pfu/ml初级单链抗体库。结论:本研究获得了全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库,为下一步筛选抗人乳腺癌细胞特异性单链抗体奠定了基础。
- 王净王慧袁媛李青
- 关键词：乳腺癌噬菌体抗体库
- 胰岛素对小鼠原代肝细胞甘油三酯合成分解代谢的影响被引量：1
- 2013年
- 目的:建立小鼠肝细胞体外培养的方法,研究不同浓度胰岛素对肝细胞甘油三酯合成代谢、分解代谢及甘油三酯含量的影响。方法:通过肝脏灌注和胶原酶消化分离小鼠肝细胞,密度梯度离心纯化后,进行体外培养。在0 nmol/L,50 nmol/L,100 nmol/L,200 nmol/L胰岛素存在的情况下培养,通过3H标记的甘油测定细胞内甘油三酯合成速率,使用3H标记的油酸预孵育,加入triacsin C抑制脂肪酸重酯化,追踪掺入3H的甘油三酯分解的速率。采用甘油三酯检测试剂盒,测定不同浓度胰岛素对细胞内甘油三酯含量的影响。结果:成功分离了小鼠原代肝细胞,存活率达90%。50 nmol/L胰岛素对细胞甘油三酯含量及甘油三酯合成分解速率影响较小。100 nmol/L胰岛素可显著增加甘油三酯合成速率,减低分解速率,使细胞内甘油三酯含量增加。200 nmo/L胰岛素反而降低甘油三酯合成速率,细胞内甘油三酯含量少于对照组(0 nmol/L)。结论:本研究成功建立了小鼠原代肝细胞分离培养的方法,使用3H标记物敏感的检测肝细胞内甘油三酯合成分解速率。研究发现,过高浓度的胰岛素反而抑制肝细胞甘油三酯的储积。
- 李航薛玲宋越王净蒋丽娜李青潘树义
- 关键词：胰岛素肝细胞甘油三酯
- 人外周血来源树突状细胞的诱导及培养方法的研究被引量：4
- 2012年
- 目的探讨从人外周血中大量培养树突状细胞(DC)的方法,并在表型、形态、结构等方面进行鉴定。方法采用5步法从人外周血中大量培养DC:①Ficoll不连续密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC);②RPMI-1640培养基离心洗涤去除血小板;③利用DC前体细胞的短暂粘附性去除悬浮细胞及粘附性较强的细胞;④用重组人白介素4(rhIL-4)、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)自外周血单个核细胞诱导分离DC;⑤用重组人肿瘤坏死因子诱导产生成熟的DC。用荧光显微镜检测DC表面分子的表达,在扫描电镜下观察DC的形态。结果获得了具有典型特征的DC前体细胞,在GM-CSF和rhIL-4协同诱导9 d后,荧光显微镜下可见DC表面CD83、CD40、HLA-DR的表达。扫描电镜观察可见:DC细胞形态不规则,从胞体辐射状伸出数个粗细不等的突起,有的长度可达胞体的2～3倍,长突起存在分叉及汇合现象。在长突起的基部存在大量短小的圆形或椭圆形突起。结论人外周血来源DC的5步培养法可获得较高数量的典型DC,且该法稳定、简便、经济,为DC的临床免疫治疗提供了实验依据。
- 张秀敏曲萍郭风袁媛王净王超王慧
- 关键词：外周血单核细胞树突状细胞
- 脂肪储存小滴蛋白5重组腺病毒的制备
- 2011年
- 目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。
- 薛玲李航张静王净吴雅岚姬秋和叶菁
- 关键词：小鼠
- 膜性肾病小鼠模型的建立与鉴定被引量：6
- 2013年
- 目的建立小鼠膜性肾病模型。方法取6周龄健康雄性BALB/c小鼠20只,分为对照组和模型组。模型组小鼠皮下注射0.2 mg阳离子牛血清白蛋白(C-BSA)和等体积的完全弗氏佐剂,对照组皮下注射生理盐水和完全弗氏佐剂。2周后,模型组小鼠尾静脉注射阳离子牛血清白蛋白,每周3次,隔日注射,对照组使用生理盐水代替。模型的鉴定则采用血液生化检查和病理检查(PASM染色、IgG免疫荧光染色、透射电镜)等方法。结果 8周后12只模型组小鼠出现高蛋白尿、低蛋白血症和高胆固醇血症;PASM染色显示出类似于早期膜性肾病,IgG免疫荧光染色显示出沿毛细血管壁呈颗粒状物沉积,透射电镜下有足突的广泛融合。结论 C-BSA尾静脉注射小鼠可成功构建小鼠膜性肾病模型。
- 王慧王净李静李乐袁媛王超叶菁李青
- 关键词：膜性肾病动物模型小鼠
