夏晓莉
- 作品数：39 被引量：145H指数：6
- 供职机构：扬州大学兽医学院更多>>
- 发文基金：江苏高校优势学科建设工程项目江苏高校优势学科建设工程资助项目长江学者和创新团队发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生哲学宗教更多>>
- 非洲猪瘟病毒p72基因的纳米金探针研究被引量：13
- 2011年
- 对22株发表的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72基因序列进行比较,找出其中的高保守性区域,各设计、合成1条与保守区域互补的5′生物素标记及3′烷巯基修饰短链寡核苷酸探针,并将烷巯基修饰的探针吸附到纳米金颗粒上,制备纳米金标记探针。PCR扩增出的p72基因中的651 bp保守核酸序列,变性后与上述生物素探针及标记纳米金探针进行杂交,杂交产物加入吸附链霉亲和素的酶标板,利用亲和原理,捕获杂交产物,银染增强法对纳米金标记探针进行信号放大。结果表明:制备的纳米金探针经银染放大后,在酶标板中形成肉眼可见的黑色沉淀,可有效检测扩增出的p72基因,检测核酸浓度达到10 fmol·L-1,可用于ASFV快速诊断。
- 张鑫宇孙怀昌刘文俊夏晓莉成大荣
- 关键词：非洲猪瘟病毒
- 非洲猪瘟病毒无标签重组B602L抗原制备与鉴定被引量：4
- 2020年
- 为了获得无标签重组抗原用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测,本研究将B602L与类弹性蛋白多肽(ELP)基因进行融合表达,利用简单、经济的相变循环(ITC)纯化ELP-B602L融合蛋白,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,再用ITC回收重组B602L蛋白;用抗体阳性猪血清对重组B602L进行鉴定;以重组B602L蛋白为包被抗原进行ELISA鉴定。结果显示重组大肠杆菌能正确表达ELP-B602L融合蛋白,纯化融合蛋白纯度大于85%;TEV蛋白酶活性包涵体切除ELP标签的效率大于90%,回收的重组B602L蛋白纯度大于90%,能与抗体阳性猪血清反应;以重组B602L蛋白为包被抗原建立的ELISA与抗体阳性血清反应为阳性,与抗体阴性血清反应为阴性,OD450值与血清稀释倍数具有线性相关性。
- 张晓凯徐保娟崔晓霞李洋洋周晓慧张鑫宇张泉夏晓莉孙怀昌
- 关键词：非洲猪瘟病毒
- 类弹性蛋白和Mxe内含肽介导的非洲猪瘟病毒重组蛋白K205R的表达与纯化被引量：1
- 2013年
- 为了构建Mxe内含肽(mxe intein,MI)和类弹性蛋白(elastin-like peptide,ELP)介导的重组蛋白表达与纯化系统,将PCR扩增的MI序列和限制性内切酶切取的ELP序列插入原核表达载体pET-30a,获得融合表达载体pET-MIE;将PCR扩增的非洲猪瘟病毒(ASFV)K205R基因插入pET-MIE载体,获得重组载体pET-K205R-MIE;分别将pET-MIE和pET-K205R-MIE转化大肠杆菌,对其重组蛋白表达、逆向相变循环沉淀及MI自体裂解条件进行优化。结果显示,在20℃条件下K205R-MIE融合蛋白为可溶性表达,26℃条件下逆向相变循环沉淀融合蛋白的回收率达73.2%,26℃孵育4h的裂解效率达91.4%,K205R蛋白的回收率为51.3%,纯度高达92.2%,能被ASFV免疫血清识别。结果提示,成功构建了简单、经济的重组蛋白表达与纯化系统,制备的K205R抗原可用于ASFV诊断。
- 刘文俊张鑫宇夏晓莉孙怀昌
- 关键词：非洲猪瘟病毒
- 非洲猪瘟病毒强免疫原性重组CD2v抗原的制备与初步应用被引量：11
- 2020年
- 旨在获得非洲猪瘟病毒(ASFV)强免疫原性重组CD2v抗原,利用生物信息学软件进行CD2v抗原指数分析,将其细胞质内免疫显性区与类弹性蛋白多肽(ELP)在重组大肠杆菌中进行融合表达,对ELP-CD2v融合蛋白的相变循环(ITC)条件进行优化,在优化条件下进行融合蛋白纯化,利用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,通过免疫转印法对重组CD2v抗原进行鉴定,利用重组CD2v抗原建立ELISA抗体检测方法,与多抗原ELISA对ASFV抗体阳性和阴性血清进行平行检测。结果显示,ELP-CD2v融合蛋白获得正确、可溶性表达,ITC条件为28℃和1.5 mol·L^-1 NaCl,在0.2%Triton X-100存在下进行ITC,纯化的融合蛋白纯度为76.3%;TEV蛋白酶活性包涵体能有效切割ELP标签,再次ITC回收的重组CD2v抗原纯度为91.7%,能被ASFV抗体识别;根据多抗原ELISA检测结果选择血清样品,用重组CD2v抗原ELISA进行检测,结果显示,15份ASFV抗体阴性血清均为CD2v抗体检测阴性,15份ASFV抗体阳性血清均为CD2v抗体检测阳性。这些研究结果表明,ASFV的CD2v蛋白胞内区存在强免疫原性表位,其重组抗原有望用于CD2v的抗体检测。
- 周晓慧肖景景张鑫宇张泉夏晓莉孙怀昌
- 关键词：非洲猪瘟病毒
- 猪CD163的分子克隆、原核表达及免疫血清制备被引量：7
- 2011年
- 采用生物信息学软件分析猪CD163结构,用RT-PCR从猪巨噬细胞RNA中扩增猪CD163前1 511 bp cDNA片段,再用PCR扩增抗原指数较高的697 bp cDNA片段,将其克隆入质粒载体进行序列测定;将cDNA片段克隆入含细胞毒性T细胞相关抗原4（CTLA-4）胞外区（IgV）编码序列的原核表达载体,用IPTG诱导重组菌表达;在变性条件下用镍亲和柱纯化融合蛋白,以每只50μg蛋白的剂量免疫小鼠3次,间接ELISA检测抗体效价;以表达CD163的猪巨噬细胞和不表达CD163的PK-15细胞膜为抗原,用Western blotting验证免疫血清的特异性,以获得猪CD163重组抗原和免疫血清,为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染机制研究提供检测试剂。结果表明：猪CD163的第45~297位氨基酸抗原指数较高,不含疏水性氨基酸集中区;RT-PCR扩增产物的大小与预期结果相符,与发表序列的核苷酸序列同源性为99.5%,氨基酸序列同源性为100%;重组大肠杆菌表达的CTLA-4 IgV-CD163s融合蛋白为预期的43 ku,主要以包涵体形式存在,通过亲和层析和尿素变性/复性获得了可溶性纯化蛋白;免疫小鼠血清的ELISA抗体效价为1∶300 000,能在CD163＋细胞中检测到预期的120 ku蛋白条带,而在CD163-细胞中未检测到相应的蛋白条带。结果提示获得的猪CD163重组抗原和免疫血清可用于PRRSV感染检测。
- 李秀媛孙怀昌宋红芹刘文俊张钰陈阳张鑫宇夏晓莉
- 关键词：分子克隆原核表达免疫血清
- 奶牛乳房炎葡萄球菌菌种的鉴定及其mecA基因与耐药性关系分析被引量：1
- 2015年
- 从209份奶牛乳房炎阳性乳样分离葡萄球菌,用PCR扩增Tuf和16S rRNA基因片段,根据序列同源性进行种的鉴定,用PCR检测mecA基因,用标准方法进行药敏试验。结果显示,分离的104株葡萄球菌分为14个种,包括金黄色葡萄球菌和13种凝固酶阴性葡萄球菌,后者主要为阿氏葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌和产色葡萄球菌,不同于国外的研究报道;松鼠葡萄球菌和溶血葡萄球菌的mecA基因检出率高达66.7%,表皮葡萄球菌达42.9%,金黄色葡萄球菌达35.7%,显著高于国内外报道;大部分葡萄球菌的β-内酰胺类抗生素耐药性与mecA基因检测不相符,可能与其他mec基因有关。
- 徐佳谭笑张鑫宇夏晓莉孙怀昌
- 关键词：奶牛乳房炎葡萄球菌MECA基因耐药性
- 表面展示RGD模体重组噬菌体的构建和鉴定
- 2017年
- 将RGD多肽编码序列克隆至辅助噬菌体M13KO7 PⅢ基因中,获得重组载体M13KO7-RGD,包装噬菌粒pAAV-GFP后获得重组噬菌体颗粒,通过透射电子显微镜观察形态,Western-blot鉴定PⅢ-RGD融合序列的表达。将其转导不同哺乳动物细胞,荧光显微镜观察报告基因的表达。结果表明:成功获得展示RGD模体的重组噬菌体颗粒,且具有典型丝状噬菌体形态特征,转导不同细胞系后有绿色荧光蛋白表达,提示该重组噬菌体能够导入哺乳动物细胞,为动物基因工程疫苗载体的研发提供新的思路。
- 夏文龙余树培郭长明朱善元张鑫宇夏晓莉孙怀昌
- 关键词：RGD模体基因导入
- 巨噬细胞特异的人工miRNA表达载体的构建与鉴定被引量：1
- 2015年
- 根据小RNA（microRNA,miRNA）前体分子结构特点而设计并合成的人工miRNA（artificial miRNA,amiRNA）也可以在体内通过与内源miRNA相同或相似的途径发挥RNA干扰（RNA interference,RNAi）作用,目前amiRNA技术在调控基因表达、抗病毒领域得到了广泛应用[1-4]。
- 宋红芹姜翠翠张鑫宇夏晓莉孙怀昌
- 关键词：巨噬细胞
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒接触感染仔猪模型的建立被引量：4
- 2019年
- 为了建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)接触感染模型,将易感仔猪与PRRSV人工感染仔猪在隔离器中同居饲养,每日观察记录体温变化和临床症状,定期采集血清和粪便样品,用荧光定量RT-PCR检测病毒血症和粪便排毒水平;对病死猪和试验结束迫杀猪进行剖检和肺脏组织病理学检查,并检测各器官病毒载量和组织分布。结果显示:接触感染仔猪出现高热和PRRS症状时间分别较人工接种猪推迟2~3d;第3天起血清检测PRRSV阳性,第10天病毒血症上升至较高水平(108.6拷贝/mL);第5天起粪便检测PRRSV阳性,第7天粪便排毒量上升至较高水平(103.9拷贝/0.1g);3头接触感染仔猪分别于同居后第12天和第13天死亡,较人工接种猪推迟1~2d,病死猪的主要器官病毒载量以及剖检和肺脏显微病理变化与人工接种病死猪相似。这些结果表明,本研究建立的接触感染仔猪模型可用于PRRS疫苗免疫效果评价。
- 夏文龙吴植郭长明朱善元张鑫宇夏晓莉孙怀昌
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征
- 非洲猪瘟病毒p30二聚体鉴定及胶体金免疫层析方法建立
- 2023年
- 为建立一种制备简单、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(ASFV)抗原快速检测方法,利用双表达载体pIRES在293A细胞上表达带有His标签和Flag标签的p30重组蛋白,裂解细胞后,通过免疫共沉淀发现p30重组蛋白以聚合体形式存在,进一步用质谱方法对原核系统表达纯化的p30重组蛋白进行分子量测定,结果证实,ASFV p30能自发形成二聚体。在此基础上,用抗p30的单克隆抗体6H9A10建立了单一单克隆抗体夹心检测p30二聚体的胶体金免疫层析方法,该方法对p30重组抗原最低检测浓度为2.1 ng·mL^(-1),对PRV、CSFV、PRRSV、PCV-2、PEDV、PPV、SVA等抗原检测结果均为阴性;用该胶体金免疫层析方法检测已知的100份临床样品,其中包含20份ASFV阴性血清、20份ASFV阴性组织、10份ASFV阴性血浆、21份ASFV阳性血清、21份ASFV阳性组织、8份ASFV阳性血浆,结果显示,检测出的48份阴性样品和49份阳性样品与已知结果一致。综上,建立的单个单克隆抗体夹心检测p30的胶体金免疫层析方法具有良好的特异性和敏感性,有望用于ASFV抗原的临床快速检测。
- 张胜楠周雅维张子羿单玉平夏晓莉张鑫宇
- 关键词：非洲猪瘟病毒P30二聚体
