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HPV-16 E1蛋白的表达、纯化及其抗体制备被引量：3: 2011年; 目的:在原核细胞中表达、纯化人乳头状瘤病毒16型(HPV-16)E1蛋白并制备HPV-16 E1特异性抗体。方法:PCR扩增HPV-16 E1基因,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株。通过改变诱导温度与IPTG浓度优化HPV-16 E1蛋白可溶性表达的条件,并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下及足垫免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blot检测血清效价和特异性。结果:酶切和测序结果表明HPV-16 E1基因已克隆入pMAL-p2x。经优化筛选出HPV-16 E1融合蛋白诱导表达的最佳条件为28℃,IPTG浓度0.5 mmol/L。经麦芽糖亲和层析法纯化获得了HPV-16 E1可溶蛋白,纯度达到95.7%。West-ern blot检测证明制备的抗血清能与HPV-16 E1蛋白特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到1∶640 000以上。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得了HPV-16 E1蛋白,该蛋白免疫新西兰白兔制备了高效价的HPV-16 E1蛋白抗血清,为HPV-16 E1功能研究提供了抗原和检测用抗体。; 史茜侯向前郭景霞朱慧马正海; 关键词：HPV-16 E1基因原核表达纯化抗体

哈萨克族食管癌中人乳头状瘤病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用: 2012年; 目的建立检测哈萨克族食管癌石蜡样本中HPV16/18(human papillomavirus 16/18,HPV16/18)病毒载量的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)方法,并探讨病毒载量与食管癌病理分级的相关性。方法分别构建HPV16/18和内参基因β-actin的重组质粒,制备质粒标准品;确定最佳实验条件,建立高灵敏度的qRT-PCR方法,并对103例经病理学确诊的哈萨克族食管癌石蜡包埋组织提取DNA后,进行HPV16/18载量的检测,分析其载量与哈萨克族食管癌病理分级的相关性。结果建立了HPV16/18和β-actin标准曲线,HPV16/18和β-actin标准品Ct值与其相应梯度稀释标准品浓度呈良好线性关系r,2>0.990,扩增效率分别为85.3%～105.0%,经溶解曲线分析产物特异。103例哈萨克族食管癌样中HPV16的检出率为18.3%,并有3例合并混合HPV18感染;其中HPV16的病毒载量在哈萨克族食管癌转移组中是未转移组中的1.35倍。结论成功建立了灵敏度较高的检测HPV16/18病毒载量的实时荧光定量PCR方法。HPV16/18感染是哈萨克族食管癌发生发展的因素之一,但其病毒载量与恶性程度相关性不显著。; 刘涛郭景霞郑树涛梁萌李秀凌刘清朱慧马正海; 关键词：哈萨克族食管癌 HPV16/18 病毒载量

一种1型单纯疱疹病毒载体系统的建立被引量：4: 2015年; 1型单纯疱疹病毒(HSV-1)作为溶瘤病毒和病毒载体的研究已有很长的历史.本研究利用细菌人工染色体技术建立了一种HSV-1载体系统.首先,将HSV-1内部反向重复序列(internal inverted repeat sequences,IR)两侧的片段克隆入p KO5获得穿梭质粒p KO5/BN,其电转含p HSVBAC的大肠杆菌后筛选获得删除IR区重组DNA的p HSVΔIR-BAC.p HSVΔIR-BAC转染Vero细胞获得删除IR区的重组病毒HSVΔIR(MH1001).上述p KO5/BN和含p HSVΔIR-BAC的大肠杆菌构成了HSV-1载体系统.利用该系统获得了表达绿色荧光蛋白EGFP的重组病毒HSVΔIR/EGFP(MH1002).MH1001和MH1002在感染的Vero细胞中增殖水平略低于野生型HSV-1,但无显著差异;Western印迹检测表明,重组病毒早期蛋白质ICP0、ICP4、ICP8、ICP22、ICP27在感染细胞中的表达水平下降;免疫荧光及激光共聚焦检测表明,重组病毒与野生型病毒均存在于细胞质中.以上结果表明,删除IR区的重组HSV-1保留了复制能力,能够携载并表达外源基因,建立的HSV-1载体系统可用于构建携载外源基因的复制型重组HSV-1.; 王雪莹赵晓飞李永鑫朱慧马正海; 关键词：1型单纯疱疹病毒病毒载体细菌人工染色体

HSV-1溶瘤病毒的研究进展被引量：4: 2012年; 1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)感染效率高且易于通过基因工程改造,已广泛应用于肿瘤治疗研究和临床实验。溶瘤HSV-1可通过基因工程改造或从HSV-1自发突变株中筛选获得。研究证实溶瘤HSV-1能够有效抑杀肿瘤细胞,可通过多种机制靶向肿瘤细胞,溶瘤HSV-1与放化疗联合使用治疗肿瘤的研究也取得了理想的结果。目前,已有多个溶瘤HSV-1进入临床试验。; 朱慧郭景霞马正海; 关键词：1型单纯疱疹病毒溶瘤病毒肿瘤治疗

携带p53基因的重组1型单纯疱疹病毒溶瘤特性的实验观察被引量：2: 2016年; 目的利用同源重组技术获得插入p53基因的重组1型单纯疱疹病毒（HSV-1），并在体外培养细胞和荷瘤小鼠中研究其溶瘤特性。方法将含p53基因的真核表达框克隆人含HSV-1同源重组臂的pK05／BN，获得重组穿梭质粒pK05／p53，其电转含pHSV△IR—BAC的大肠杆菌后，筛选获得含有p53的重组DNApHSVAIR—BAC／053。pHSV△IR-BAC／053转染Vero细胞获得重组病毒，经Southem印迹和Western印迹鉴定正确后命名为MH1004。分别检测MH1004感染多种肿瘤细胞24h后的滴度，分析其在肿瘤细胞中的复制特性。建立小鼠黑色素瘤模型，于0、3、6d瘤内分别注射2×106 PFU的MH1004、未插入p53基因的重组HSV-1（MH1001）、HSV-1wt和PBS，观察肿瘤大小和小鼠生存时间并作统计学分析。结果Western印迹检测表明MHl01M所携带的p53基因可在感染细胞中表达；在同种肿瘤细胞中，MHIOIM和HSV-1wt的复制水平差异无统计学意义（P〉O．05）；MH1004在SK—N．SH和U251细胞中的复制水平显著高于其在其他肿瘤细胞中的复制水平；治疗15d后，HSV-1 wt、MH1001和MHl004组小鼠的肿瘤体积分别为（6180±751）、（5760±267）和（4850±532）mm3，显著小于PBS对照组（9860±91）mm3（均P〈0．01），MHl004组肿瘤体积小于MH1001组和HSV．1wt组，但差异均无统计学意义（均P〉0．05）。MH1004组小鼠生存率（5／6）显著高于PBS组（3／6）、HSV-1wt组（3／6）和MHl001组（3／6）。结论MH1004在神经肿瘤细胞中的复制水平较高，能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，并延长荷瘤小鼠的生存期。; 王雪莹朱慧汪习刘晓娟马正海; 关键词：溶瘤病毒

采用报告基因检测HSV-1潜伏相关启动子在神经细胞的特异性激活: 2011年; 1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)潜伏相关转录本启动子(latencyassociated transcripts promoter,LATP)在病毒于神经组织中潜伏感染期间保持活性.本研究利用PCR技术扩增获得HSV-1的LATP,并将LATP分别插入增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein,EGFP)基因和荧光素酶基因前,获得真核表达质粒pcDNA/LATP/EGFP和pGL3/LATP/Luc.pcDNA/LATP/EGFP转染293T细胞后,检测到绿色荧光蛋白基因的表达,表明LATP具有启动子活性,其活性低于PCMV.继而以pcDNA/LATP/EGFP和pGL3/LATP/Luc分别转染HeLa细胞、Eca109细胞、U251细胞和SK-N-SH细胞.结果表明,绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因在U251和SK-N-SH两种神经细胞中表达水平极显著(P<0.01),高于其在HeLa和Eca109两种非神经细胞中的表达.说明LATP能够驱动基因在神经组织细胞中高效表达,可作为神经组织特异性表达元件.; 郭景霞李永鑫朱慧史茜张彩荣朱红娟马正海; 关键词：1型单纯疱疹病毒启动子神经组织

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朱慧

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