李福胜
- 作品数：17 被引量：60H指数：4
- 供职机构：中国预防医学科学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 一组通用性温控型大肠杆菌高效表达载体的组建及其应用
- 张智清侯云德李福胜金冬雁金奇李玉英
- 用原核细胞生产多肽药物的关键是要有高效的原核表达载体，使外源基因能转送到细菌细胞内并获得高效表达。我们采用DNA重组技术和人工合成DNA的方法组建了一组通用性较强的，可温控的，可表达非融合蛋白的高拷贝高效表达载体-pBV...
- 关键词：
- 关键词：大肠杆菌高效表达载体DNA重组
- 两种基于pBV220载体的新型载体
- 本发明包括两种基于pBV220的原核高效表达载体，采用PRPL启动子，一个是在表达产物的氨基端携带有6组氨酸，便于对表达产物的快速纯化；另一个是在pBV220载体上克隆入四环素抗性基因，通过建立外源基因的5′端随机序列库...
- 李福胜张智清侯云德贡惠宇
- 文献传递
- 我国分离的甲病毒YN87448毒株全部结构区基因核苷酸的序列测定及分析被引量：19
- 1999年
- Ｙ Ｎ８７４４８ 毒株１９８６ 年分离自云南傣族５２ 岁女发热病人的血液标本，曾用血清学方法鉴定为披膜病毒科甲病毒属。用我们创立的单引物差异 Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 方法及简并引物 Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 法均已证明：该病毒为甲病毒属的辛德毕斯样病毒（ Ｓｉｎｄｂｉｓ － ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ） 。本研究从甲病毒属的病毒基因序列的共同保守区，设计４ 对引物。用 Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 方法扩增，再将扩增片段分别连结克隆到ｐ Ｇ Ｅ Ｍ－ Ｔ 载体。通过对４ 个克隆的测序完成了对 Ｙ Ｎ８７４４８ 毒株的全部结构区基因序列的测定，结果表明：（１） Ｙ Ｎ８７４４８ 病毒的全部结构区基因序列长度为４ ０５９ 个核苷酸（ 不包括多聚腺苷酸尾） ；（２） Ｙ Ｎ８７４４８ 病毒的全部结构区基因与辛德毕斯病毒家族中毒力最强的、唯一能致成年小鼠１００ ％ 死亡的、南非分离的辛德毕斯样病毒 Ｓ Ａ Ａ Ｒ８６ 株相应基因的核苷酸序列同源性为９９ ％ ，但 Ｙ Ｎ８７４４８ 毒株不致成年小鼠死亡；（３） 二者基因结构上有一点大的差异是， Ｙ Ｎ８７４４８ 病毒位于基因组８ ６４１ｂｐ 处的结构区基因 Ｅ２ 和 Ｅ３ 之间多出３ 个核苷酸（ Ａ Ａ Ａ） ；（４） 与其它甲属病毒的进化树比较来看?
- 周国林梁国栋李蕾付士红李福胜金奇张海林黄文丽侯云德
- 关键词：克隆RT-PCR核苷酸
- GM-CSF(12-127)突变体生物学活性的研究被引量：4
- 1996年
- GM－CSF的结构与功能研究表明，N-端的1～13位氨基酸并非生物学活性所必需，且干扰与受体的结合。作者采用PCR突变的方法删除1～11位的氨基酸，保留12位的脯氨酸。突变后的基因经全序列测定证实，之后插入原核高效表达载体pBV220中表达，基因突变后的表达量及表达产物的稳定性均有所提高。大批量表达后经提取包涵体、疏水层析、离子交换层析，最终获得了纯的GM－CSF（12－127）突变体蛋白，其生物学活性比未突变蛋白有明显提高，达3×107U／mg蛋白。受体竞争结合实验显示突变体蛋白受体亲和活性增强。
- 李福胜张智清邵华刘红兵侯云德
- 关键词：GM-CSF粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
- 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在大肠杆菌中的高效表达及快速纯化工艺的建立被引量：4
- 1998年
- 基因工程重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）主要用于癌症患者化疗后的粒细胞减少症．在正确克隆人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的基础上，重点对Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的５′端进行了较为彻底的修饰，修饰后的基因插入ｐＢＶ２２０载体组建成功ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ／２－１７４高效表达载体．表达后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析其表达最高达５０％以上．根据Ｇ－ＣＳＦ表达形成包涵体这一特性，建立了一条简便、稳定，适用于大规模生产的分离纯化工艺流程．首先分离纯化包涵体，８ｍｏｌ／Ｌ尿素裂解包涵体，稀释复性蛋白，之后一步ＳＰ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱层析至均质．纯化的Ｇ－ＣＳＦ比活性达３．４×１０８Ｕ／ｍｇ蛋白，每升表达菌液回收的Ｇ－ＣＳＦ总活性达１．０６×１０１１Ｕ．纯化产物的Ｎ－端氨基酸序列分析表明，对甲硫氨酸的去除彻底。
- 李福胜贡惠宇赵炳文余彩玲侯斌陈爱君张智清侯云德
- 关键词：G-CSF原核表达纯化PBV220基因修饰
- 中国分离的甲属病毒YN87448毒株非结构区基因的核苷酸序列测定及分析被引量：21
- 1999年
- 目的 研究我国首例从发热病人血清中分离的YN87448病毒的分子致病基础。方法 甲属病毒基因序列保守区设计引物,用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法扩增,再将扩增片段克隆到pGEMT载体。测定YN87448毒株非结构基因序列。结果 YN87448病毒非结构区基因序列为7613个核苷酸(不包括5′端帽子结构),编码非结构蛋白1(nsP1),非结构蛋白2(nsP2),非结构蛋白3(nsP3),非结构蛋白4(nsP4);有一个起始密码子(ATG)位于第60位碱基;含有2个终止密码子(TGA),分别位于基因组nsP3基因和nsP4基因的末端。YN87448病毒非结构区基因与辛德毕斯病毒家族中唯一能致成年小鼠死亡的S.A.AR86株相应基因的核苷酸序列同源性为988%,但YN87448毒株不致成年小鼠死亡。与S.A.AR86株相比,基因结构上有三点明显差异:YN87448毒株在nsP3区位于基因组5256bp5309bp含54个核苷酸的插入;位于基因组5603bp处3个核苷酸(AGT)的缺失;在nsP3和nsP4之间有乳白突变终止密码子(TGA)。此序列已输入GeneBank,序列号为AF103734。结论 YN87448为一株新的辛德毕斯病毒株。
- 周国林梁国栋李蕾付士红李福胜金奇张海林黄文丽侯云德
- 关键词：甲病毒属分子克隆聚合酶链反应碱基序列
- 一种具有较高生物学活性的GM-CSF突变体及制法
- 本发明是GM-CSF的一种突变体，删除氨基端的1-11位的氨基酸，由此构建的突变体具有较高的生物学活性、较高的受体亲和力、较长的体内半衰期。在以上几个方面优于天然结构的GM-CSF。
- 李福胜张智清侯云德颜子颖
- 文献传递
- 人肝癌特异性EB病毒载体-p^(EBAF)介导hGM-CSF基因的转移及表达被引量：3
- 2001年
- 目的 :探索人粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子 (hGM -CSF)基因在肝癌细胞中特异性表达的新途径。方法 :构建 pEBAF/hGM -CSF基因克隆 ,用脂质体转染法将它分别导入分泌甲胎蛋白 (AFP)的肝癌细胞株HepG2和不分泌APF的细胞株SMMC772 1,构建两转基因的细胞克隆HepG2 /hGM -CSF、SMMC772 1/hGM-CSF ,用MTT比色法测定细胞上清中hGM -CSF活性。结果 :HepG2 /hGM -CSF细胞上清hGM -CSF活性平均为 46 .5ng/ml/10 6/2 4h ,SMMC772 1细胞上清中无明显hGM -CSF活性。结论
- 李玉富张俊萍孙声桃李继昌李福胜张智清
- 关键词：基因治疗肝癌
- 四环素抗性表型筛选外源基因高效表达克隆
- 2001年
- 目的 :应用四环素抗性表型从外源基因的cDNA文库中筛选高效表达克隆。方法 :将四环素抗性基因(TetR)克隆到载体pBV2 2 0 中构建筛选载体pBV2 2 3 ;根据氨基酸密码子的简并性 ,在保持原有氨基酸序列不变的情况下 ,人工合成外源基因的cDNA 5′端简并引物库 ,以hGM CSF基因为例进行筛选。把hGM CSFcDNA简并文库克隆到pBV2 2 3 中的TetR 上游位置 ,构建pBV2 2 3 /hGM CSF克隆文库 ,导入大肠杆菌DH5α中 ,构建转基因的细菌文库 ,在不同质量浓度 (2 0mg/L ,40mg/L ,5 0mg/L ,6 0mg/L)的四环素培养基中培养。结果 :从高浓度四环素培养基中获得高效表达的pBV2 2 3 /hGM CSF克隆 ,测序结果显示该克隆的hGM CSFcDNA 5′端序列与天然序列比较有 7个碱基发生突变 ,且符合实验设计的要求。通过基因重组 ,构建成最终的高效表达克隆pBV2 2 0 /hGM CSF ,其表达hGM CSF的量占细菌总量的 18% ,较原表达水平提高 80 %。结论 :可通过四环素抗性筛选系统筛选外源基因的高效表达克隆。
- 李玉富孙声桃李继昌李福胜张智清
- 关键词：克隆CDNA文库外源基因
- 在人肝癌细胞特异表达的自主复制型载体及其用途
- 一种在人肝癌细胞特异病毒的自主复制型载体及其用途，它是由肝癌细胞特异的启动子—甲胎蛋白基因的启动子、EB病毒质粒型复制子及其反式作用因子、真核细胞抗性选择标志、和带大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌质粒骨架所组...
- 颜子颖侯云德乔健李福胜
- 文献传递
