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解耦联蛋白-2基因敲除减轻高脂饮食诱导小鼠脂肪肝缺血再灌注损伤: 2010年; 目的观察解耦联蛋白-2（UCP-2）基因在脂肪肝缺血再灌注损伤中的作用,探讨以UCP-2为靶点的脂肪供肝预处理新途径.方法实验动物分为3组：实验组（A组）：UCP-2基因敲除小鼠,给予高脂饮食（n=20）;空白对照组（B组）：野生型同系小鼠,给予正常饮食（n=20）;阴性对照组（C组）：野生型同系小鼠,给予高脂饮食（n=20）.喂养6个月,建屯小鼠脂肪肝模型.各组小鼠阻断门静脉缺血15 min,再灌注24 h后处死,检测肝组织中UCP-2基因表达及三磷酸腺苷（ATP）、活性氧族（ROS）、乳酸脱氢酶（LDH）水平;并行血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）检测及肝组织病理学检测.结果高脂饮食喂养6个月后成功建立小鼠脂肪肝模型;Western blot证实A组小鼠UCP-2无表达,C组表达明显高于B组;A组ALT、AST、ATP、ROS、LDH的定量值为：（55.33±5.51）、（128.33±7.02）U/L、（28.00±2.00）nmol/L、（165.33±7.09）、（1176.00±22.27）U/pmt;B组上述指标为（25.00±4.58）、（85.33±4.51）U/L、（24.33±4.16）nmol/L、（147.33±7.51）、（707.33±31.64）U/prot;C组为（142.67±13.01）、（220.67±7.02）U/L、（8.67±1.53）nmol/L、（65.00±5.00）、（1748.33±42.52）U/prot,A组和C组差异有统计学意义（P〈0.05）;病理检测表明A组损伤轻于C组.结论抑制解耦联蛋白-2基因表达能在减轻小鼠脂肪肝急性损伤.; 程锐王帅刘涛王春友万赤丹; 关键词：脂肪肝缺血再灌注损伤

过表达解偶联蛋白-2基因加重原代肝细胞急性损伤被引量：1: 2009年; 目的研究解偶联蛋白-2(uncoupling protein-2,UCP-2)基因在肝细胞急性损伤过程中的作用。方法构建小鼠UCP-2基因过表达慢病毒载体;二步胶原酶灌注法分离培养小鼠原代肝细胞;慢病毒感染肝细胞,使肝细胞中UCP-2基因表达上调;荧光显微镜镜检确定感染效率,Real ti me PCR检测UCP-2表达;肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作用于病毒感染肝细胞24 h后,检测细胞上清液中谷丙转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)水平;碘化丙啶(PI)染色流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡因子Caspase 3的活化。结果Real ti me PCR检测证实目的细胞中UCP-2表达上调;TNF-α作用后病毒感染的实验组上清液中ALT和LDH水平、细胞凋亡率、凋亡因子Caspase 3活化程度均高于对照组(均P<0.05)。结论UCP-2基因过度表达可加重肝细胞急性损伤。; 万赤丹程锐王春友王宏博王帅刘涛; 关键词：解偶联蛋白-2 慢病毒肝细胞损伤

脂肪来源间充质干细胞对大鼠肝移植的免疫调节作用被引量：7: 2007年; 目的探讨大鼠脂肪来源问充质干细胞（MSC）对大鼠肝移植术后急性排斥反应的作用。方法分离、培养sD大鼠MSC，体外混合淋巴细胞培养（MLC）体系中，研究MSC对Wistar大鼠T细胞增殖的抑制作用。以SD与Wistar大鼠为供受体建立肝移植模型。随机分为MSC处理组与空白对照组，术后第7天检测肝功能、血清白细胞介素（IL）-2和白细胞介素（IL）-10水平、肝组织病理形态及肝细胞凋亡。结果体外MLC中，Wistar大鼠T细胞增殖明显受抑，抑制率为48．44％。实验组血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、IL-2、IL-10分别为（134．2±45．0）、（162．5±30．5）U／L、（30．6±5．4）umol／L、（187．35±18．26）、（193．95±37．62）ug／L；对照组上述指标分别为（355．6±54．3）、（296．4±71．2）U／L、（145．7±28．6）umol／L、（295．73±57．15）、（75．12±11．23）ug/L，两组差异有统计学意义（P〈0．05）；病检提示实验组排斥反应较对照组明显减轻；脱氧脲核苷酸缺口末端标记（TUNEL）检测提示实验组肝细胞凋亡程度明显低于对照组（P〈0．05）。结论供体来源MSC能明显抑制MLC体系中受体源T细胞的增殖，并能显著减轻大鼠肝移植术后急性排斥反应。; 万赤丹程锐王宏博刘涛; 关键词：脂肪组织间充质干细胞肝移植急性排斥反应

抑制解偶联蛋白-2基因表达减轻急性脂肪肝细胞损伤: 2008年; 目的探讨下调解偶联蛋白2（UCP-2）基因的表达对脂肪肝细胞损伤的影响，为存在脂肪变性的供肝提供治疗靶点。方法采用二步胶原酶灌注法分离C57BL／6 J—ob／ob转基因肥胖小鼠的原代脂肪肝细胞，用靶向小鼠UCP-2基因的RNA干扰慢病毒载体感染所获得的脂肪肝细胞，实现对UCP2基因的特异性敲减（实验组），另以空载体感染的脂肪肝细胞为对照。荧光显微镜镜检确定感染效率，实时聚合酶链反应鉴定敲减效果。以肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作用于感染后的肝细胞，24h后以碘化丙啶染色。流式细胞仪检测细胞凋亡情况；Western印迹法检测凋亡蛋白酶-3（Caspase-3）的活化。结果UCP2基因表达被有效抑制，UCP-2基因的敲减率约为75％。实验组的肝细胞凋亡率为（4．97±0．25）％，明显低于对照组的（21．13±1．28）%（P〈0．05），其Caspase-3的活化程度也低于对照组。结论抑制UCP-2基因表达能减轻脂肪肝细胞的损伤。; 程锐王春友刘涛王宏博王帅万赤丹; 关键词：解偶联蛋白-2 基因表达脂肪肝细胞死亡

解偶联蛋白-2 RNA干扰慢病毒载体的构建被引量：1: 2008年; 目的:构建解偶联蛋白-2(UCP-2)基因的RNA干扰慢病毒载体。方法:根据RNA干扰序列设计原则,针对UCP-2mRNA(NM_011671)设计3个RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的DNA双链,酶切后连入慢病毒转移质粒pGCL-GFP中。连接产物转化感受态细胞,所获克隆行PCR鉴定和序列测定。构建成功的RNA干扰质粒与UCP-2表达质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观测转染效果,Western blot检测UCP-2蛋白表达,筛选出干扰效果最好RNA干扰质粒。将该质粒与两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0(gag/pol元件)载体,Helper2.0(VSVG元件)共转染293T细胞包装成慢病毒并检测滴度。结果:PCR和测序结果显示针对3个靶点的RNA干扰质粒均构建成功;通过Westernblot检测获得最优干扰靶点,并成功包装成滴度为5×108TU/ml的慢病毒。结论:成功构建可供感染的解偶联蛋白-2RNA干扰慢病毒载体,为后续靶向抑制该基因表达以提高脂肪肝移植成功率的研究奠定物质基础。; 万赤丹程锐王春友王宏博王帅刘涛; 关键词：解偶联蛋白-2 RNA干扰慢病毒

解偶联蛋白2过度表达对LO2肝细胞缺血再灌注损伤的影响被引量：3: 2008年; 目的探讨解偶联蛋白-2(uncoupling protein-2,UCP-2)的过度表达对人LO2肝细胞系缺血再灌注损伤的影响及可能机制。方法构建UCP-2真核表达质粒,转染LO2肝细胞并筛选出阳性克隆进行鉴定。将转染重组质粒组和对照组肝细胞进行缺血再灌注处理后,采用原位Hoechest/PI染色,荧光显微镜观察细胞损伤情况,AnnexinⅤ/PI双标流式细胞仪检测细胞坏死率、凋亡率和存活率,并检测细胞内三磷酸腺苷(ATP)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)水平。结果转染重组质粒组细胞在缺血再灌注后遭受的损伤显著重于对照组,转染重组质粒组细胞内ATP水平显著低于对照组,细胞坏死率、凋亡率、存活率与对照组细胞比较差异均有显著性意义(P<0.05)。结论肝细胞内UCP-2的过度表达加剧了缺血再灌注后细胞内ATP的耗竭,导致细胞遭受更为严重的损伤。; 万赤丹王宏博冯贤松刘涛程锐勾善淼; 关键词：解偶联蛋白-2 缺血再灌注损伤肝细胞

解偶联蛋白-2基因过表达慢病毒载体的构建: 2009年; 目的构建解偶联蛋白-2(UCP-2)基因慢病毒表达载体。方法用RT-PCR技术从转基因肥胖小鼠肝脏组织中获得UCP-2基因编码区片段,用In-Fusio技术将PCR产物连接入Age I单酶切后的慢病毒转移质粒体pGC-FU,进行鉴定及序列测定。将构建成功的转移质粒和两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0、Helper2.0(VS-VG元件)共转染293T细胞,包装成慢病毒,浓缩纯化后检测滴度。结果RT-PCR产物经电泳证实成功获取UCP-2基因cDNA克隆,鉴定证实慢病毒转移质粒连接构建正确,病毒包装滴度为2×108TU/ml。结论成功构建了UCP-2基因慢病毒表达载体。; 程锐王春友刘涛童强万赤丹; 关键词：解偶联蛋白-2 慢病毒表达载体脂肪肝

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程锐

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