李向云
- 作品数：11 被引量：10H指数：2
- 供职机构：第三军医大学大坪医院野战外科研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人eIF4A3真核表达载体构建及稳定表达细胞株筛选被引量：2
- 2011年
- 目的构建人eIF4A3重组质粒载体,筛选高表达人eIF4A3的稳定细胞株。方法 RT-PCR克隆eIF4A3基因,将获得的基因片段分别连接到含有HA和c-myc标签的质粒载体上,转染HeLa细胞,经G418筛选获稳定表达细胞株,在体外翻译体系中进行体外翻译,通过免疫印迹鉴定eIF4A3的表达。结果成功构建人eIF4A3的真核表达载体,可在HeLa细胞中稳定表达,且能在体外翻译体系中翻译eIF4A3蛋白质。功能研究初步证明eIF4A3可以抑制荧光素酶报告基因的表达。结论获得了可稳定高表达人eIF4A3的HeLa细胞株及可用于体外翻译的真核表达载体。
- 李向云徐祥李秉煦黄宏徐云升
- 蛋白激酶B／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路关键蛋白在糖尿病大鼠皮肤组织和创面组织中的表达研究被引量：2
- 2016年
- 目的探讨糖尿病大鼠皮肤组织和创面组织中蛋白激酶B／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Akt／mTOR）信号通路关键蛋白的表达变化，并探讨相关机制。方法选取7～8周龄SD大鼠78只，按照随机数字表法分为糖尿病组和非糖尿病组，每组39只。糖尿病组大鼠一次性快速腹腔注射20mg／mL链脲佐菌素液（65mg／kg，采用柠檬酸缓冲液配制），建立糖尿病模型；非糖尿病组大鼠同法注射等量的柠檬酸缓冲液。于注射后1～8周2组每周各取3只大鼠，于背部切取约1．0cm×1．0cm的全层皮肤，行HE染色观测表皮厚度。注射后1周，2组各取15只大鼠同前取皮造成全层皮肤缺损，于伤后即刻及1、3、5、7d每组各取3只大鼠处死，伤后即刻每只大鼠沿创缘切取1块皮肤组织、伤后1～7d每只大鼠切取创面组织，取一部分组织采用蛋白质印迹法检测皮肤组织及创面组织中的Akt、磷酸化Akt、mTOR、磷酸化mTOR的蛋白表达水平；取剩余组织行免疫荧光染色，观察皮肤组织及创面组织中的磷酸化Akt与波形蛋白表达。对数据行析因设计方差分析、多重t检验。结果（1）注射后1、2周，2组大鼠表皮厚度相似（t值分别为0．25、1．33，P值均大于0．05）；与非糖尿病组比较，注射后3周起糖尿病组大鼠表皮厚度明显变薄（t值为4．44～9．71，P〈0．05或P〈0．01）。（2）与伤后即刻皮肤组织比较，非糖尿病组大鼠伤后1～7d创面组织Akt、磷酸化Akt、roTOR（伤后3d除外）及磷酸化mTOR蛋白表达水平明显升高，t值为3．75～21．44，P〈0．05或P〈0．01。与伤后即刻皮肤组织比较，糖尿病组大鼠伤后1～7d创面组织中Akt、roTOR蛋白表达水平（伤后ldmTOR除外）无明显变化（t值为0．03～2．32，P值均大于0．05）；伤后1～7d创面组织中磷酸化Akt（伤后1d除外）、磷酸化roTOR蛋白表达水平均明显升高（t值为3．79～8．11，P〈0．
- 黄宏邱伟朱明张娅崔文慧邢伟李向云安天琛陈民佳郭韡徐祥
- 关键词：皮肤
- 重组原核表达载体pGEX-4T-1-eIF5A的构建及表达被引量：1
- 2012年
- 目的构建人eIF5A基因的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达pGEX-4T-1-eIF5A融合蛋白。方法以pCMV6-XL4-eIF5A作为模板,经PCR技术扩增目的片段,将获得的目的片段重组到原核表达载体pGEX-4T-1上,经酶切鉴定、DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-eIF5A转化到E.coliBL21内,经IPTG诱导后,GSTpull-down后SDS-PAGE电泳分析以及Western blot检测人eIF5A的表达。结果成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-eIF5A,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致,GSTpull-down后电泳分析以及Westernblot结果说明大肠杆菌BL21诱导后表达出人eIF5A的glutathioneS-transferase(GST)融合蛋白。功能研究初步证明重组eIF5A在细胞增殖过程中发挥重要作用。结论构建成功的重组原核表达载体能在E.coliBL21内表达eIF5A的GST融合蛋白,为进一步研究人eIF5A蛋白的结构和生理功能如促进创伤修复提供帮助。
- 邱伟李向云王晓慧徐祥黄宏徐云升
- 关键词：质粒融合蛋白
- HDAC2磷酸化区域突变体的构建及其对小鼠成纤维细胞增殖的影响
- 2015年
- 目的应用片段缺失突变技术鉴定HDAC2自身磷酸化对其Sumo-E3连接酶活性及蛋白质翻译的影响。方法以前期获得的鼠源性HDAC2Sumo-E3连接酶结构域基因片段为模板,设计片段缺失突变引物,经长片段重叠延伸PCR技术扩增获得片段缺失突变基因片段,后于Top10大肠杆菌中自然连接扩增获得pcDNA3.1/HDAC2-Sumo-E3连接酶磷酸化结构域缺失突变的真核表达载体。然后将载体转染于L929成纤维细胞瞬时过表达突变基因,再经翻译反应性荧光素酶报告基因实验和Western-blot鉴定HDAC2自身磷酸化修饰对Sumo-E3连接酶介导的报告基因和靶蛋白质表达的影响。最后通过MTT实验检测HDAC2自身磷酸化修饰对其Sumo-E3连接酶介导的L929细胞增殖的影响。结果成功构建获得磷酸化修饰完全缺失的HDAC2片段缺失突变体pcDNA3.1/HDAC2-Sumo-E3(DEL 394-424AA)。LUC报告基因检测结果显示,DEL 394-424AA片段缺失突变体促进LUC翻译是对照组的4.24倍,且能显著促进靶蛋白ODC和c-Myc的表达,以及L929小鼠成纤维细胞的增殖效应。结论 HDAC2自身磷酸化修饰对HDAC2Sumo-E3连接酶活性及其调节的蛋白质翻译和细胞增殖作用起负性调节作用。
- 肖勇黄宏郭韡邢伟李向云袁培淞徐祥
- 关键词：磷酸化修饰成纤维细胞
- Akt/mTOR信号通路介导低浓度过氧化氢对小鼠表皮干细胞的促增殖作用
- 2015年
- 目的:探讨低浓度过氧化氢(H_2O_2)对小鼠表皮干细胞(mESCs)体外促增殖作用及其机制。方法:以酶消化法分离培养mESCs。免疫荧光技术鉴定第3代mESCsβ1整合素和角蛋白19(K19)表达,流式细胞术鉴定CD34的表达;以不同低浓度H_2O_2(0、25、50、100、150和200μmol/L)处理mESCs 48 h和72h。同时,另一组实验中在用不同浓度H_2O_2刺激的同时加入或不加入雷帕霉素(50 ng/ml)培养48 h。甲氮甲唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;Western Blot法检测H_2O_2刺激小鼠mESCs 48 h Akt/mTOR信号通路关键蛋白mTOR、Akt、P70s6k、e IF4E、4E-BP1、p-mTOR、p-Akt、p-P70s6k、p-eIF4E、p-4E-BP1和细胞增殖相关蛋白Cyclin D1、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果:免疫荧光技术检测分离培养的mESCs细胞100%表达β1整合素和K19;流式细胞术检测99.8%的mESCs表达CD34;MTT检测结果显示,48 h和72 h时25μmol/L和50μmol/L的H_2O_2可以有效地促进mESCs的增殖(P<0.05),而雷帕霉素能拮抗这一效应;但当H_2O_2浓度为200μmol/L时,则显著抑制mESCs增殖(P<0.05);免疫印迹结果显示低浓度H_2O_2处理mESCs 48 h后,Akt/mTOR信号通路关键蛋白mTOR、Akt、eIF4E、4E-BP1水平及其磷酸化水平(p-mTOR、p-eIF4E、p-4E-BP1)显著增加(P<0.05或P<0.01),当H_2O_2浓度为200μmol/L时则抑制其表达(P<0.05或P<0.01)。此外,50μmol/L的H_2O_2能上调细胞周期蛋白Cyclin D1和PCNA的表达,而雷帕霉素能拮抗这一作用。结论:低浓度的H_2O_2对mESCs有明显的促增殖作用,并且能激活Akt/mTOR通路。而低浓度H_2O_2对mESCs的促增殖作用至少部分是通过活化Akt/mTOR信号通路介导的。
- 亓俊华聂刚吴梅刘晓萍陈民佳朱明袁培松张娅宋昱庆郭韡邢伟李向云罗东林黄宏徐祥
- 关键词：表皮干细胞过氧化氢
- 组蛋白去乙酰化酶HDAC2突变体构建及其SUMO修饰E3连接酶功能研究被引量：2
- 2013年
- 目的:针对人源HDAC2外显子拼接功能区(CDS)基因,运用双管法突变体构建技术,构建HDAC2去乙酰化酶功能失活的片段缺失与关键位点突变体,检测突变体的SUMO化修饰E3连接酶功能活性,探究此HDAC2新功能是否受到其固有的去乙酰化酶功能的影响。方法:设计HDAC2 100-322位氨基酸密码子缺失的片段突变体引物与142位H→A点突变体引物,利用HDAC2的pcDNA3.1真核表达质粒为模板,通过耐热Fusion酶PCR反应双管扩增相应的单链DNA,并经退火、模板酶切、乙醇纯化、感受态转化、抗性平板筛选、测序鉴定获得两种HDAC2去乙酰化酶功能失活的pcDNA3.1真核表达质粒。免疫印迹检测突变体质粒在细胞中的表达,荧光素酶(LUC)报告基因实验检测其SUMO化修饰E3连接酶功能活性。结果:成功构建HDAC2去乙酰化功能失活的片段缺失突变体pcDNA3.1/HDAC2(DEL 100-322AA)与关键位点突变体pcDNA3.1/HDAC2(142 H→A)。C-myc标签的免疫印迹检测显示两种突变体在细胞中可稳定表达。将突变体转染进入三种细胞,LUC报告基因分析结果显示突变体仍具有E3连接酶功能活性。结论:HDAC2的E3连接酶功能不依赖于其去乙酰化酶活性,并且E3连接酶功能结构域位于其序列C端。
- 郭韡熊渊黄宏邢伟李向云徐祥
- 关键词：突变体E3连接酶
- 抗瘢痕和组织纤维化寡聚双链核苷酸药物及其应用
- 本发明公开了一种双功能抗瘢痕和组织纤维化双链寡聚核苷酸药物，所述的核酸药物的序列包含TGACTCA、TTACCTCA、AGCCAGACA和ATGCAGACA核酸序列或其功能等价物，这四种核心核酸序列包含于双链圈套核苷酸的...
- 徐祥郭韡邢伟黄宏李向云罗安雄陈东风
- 文献传递
- 川芎嗪抑制mTOR信号通路介导的帽依赖性翻译而诱导HRPC细胞凋亡被引量：3
- 2016年
- 目的明确川芎嗪(Ligustrazine,TMP)对激素抵抗性前列腺癌(hormone-refractory prostate cancer,HRPC)细胞PC-3的促凋亡效应并探讨其分子机制,评价TMP对正常前列腺上皮细胞RWPE-1的影响。方法分别用不同终浓度的TMP处理PC-3细胞和RWPE-1细胞48、72 h后,行MTT实验及Annexin V/PI染色法评价TMP对这两种细胞活性及凋亡的影响;Western blot检测TMP对PC-3细胞中mTOR信号通路活化情况及凋亡相关蛋白表达的影响;pull-down及荧光素酶报告基因实验研究TMP对PC-3细胞中翻译起始复合物形成及帽依赖性翻译的影响。结果 TMP对RWPE-1细胞的活性及存活无显著影响,但以剂量依赖及时间依赖的方式抑制PC-3细胞的活性,当TMP浓度≥25μmol/L时,差异具有统计学意义(P<0.05);与0μmol/L处理组相比,50、100μmol/L TMP处理24 h即可显著上调PC-3细胞中Bax/Bcl-2比值及Caspase-3的表达,处理后48 h检测发现PC-3细胞发生明显的凋亡(P<0.01);与0μmol/L处理组相比,50、100μmol/L TMP显著抑制PC-3细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)及mTOR下游关键蛋白4EBP1和p70S6K的磷酸化,影响翻译起始复合物eIF4F的形成,进而抑制相关蛋白质的帽依赖性翻译及合成。结论 TMP可通过抑制mTOR信号通路的活化来降低HRPC细胞中增殖及抗凋亡相关蛋白的帽依赖性翻译,进而促进其凋亡。
- 刘中禄朱明卢汀郭韡邢伟安天琛李向云何骁赵榕森袁洪峰黄宏
- 关键词：川芎嗪激素抵抗性前列腺癌细胞凋亡
- 人SUMO-2 shRNA干扰表达载体构建及其对细胞增殖的影响
- 2013年
- 目的构建干扰人SUMO-2表达的shRNA重组质粒载体,并筛选下调人SUMO-2表达的稳定细胞株。方法设计并合成针对人SUMO-2的shRNA寡核苷酸,并将其克隆至pLKO.1质粒载体上,转染HCT116细胞后经嘌呤霉素筛选获稳定表达细胞株,并通过免疫印迹鉴定SUMO-2的表达。结果成功构建干扰人SUMO-2表达的pLKO.1质粒载体,可在HCT116细胞中稳定表达,且能有效抑制SUMO-2蛋白质的表达。功能研究初步证明干扰SUMO-2表达可抑制细胞增殖并使处于细胞周期G1期的细胞比例上升。结论获得了干扰人SUMO-2表达的pLKO.1-shRNA质粒载体,以及下调SUMO-2表达的HCT116稳定细胞株。
- 李向云黄宏邢伟郭韡何静孙志亚徐祥
- 关键词：SHRNA干扰下调细胞增殖细胞周期
- BPI-LL37抗菌融合蛋白质表达载体的构建与功能鉴定
- 2015年
- 目的构建杀菌/通透性增加蛋白和LL37抗菌蛋白的融合蛋白（BPI-LL37）表达载体,获得针对脓毒症治疗的多效抗菌融合蛋白,为脓毒症治疗提供新的措施。方法通过PCR方法从杀菌/通透性增加蛋白（bactericidal/permeability-increasing protein,BPI）和LL37基因的c DNA中扩增并修饰获得需要的r BPI21和LL37活性片断,构建r BPI21-LL37/LL37-r BPI21融合蛋白的表达载体,构建的表达载体（p LVX-Tight-Puro）上的BPI和LL37基因之间通过柔性片段（GGSGG）连接。之后使用Poly JetTM体外DNA转染试剂转染人肺腺癌细胞A549。通过Western blot检测真核细胞A549表达融合蛋白的水平,通过抑菌试验验证此融合蛋白的分泌与抗菌能力。结果经限制内酶切酶切、DNA电泳和DNA测序证明融合蛋白表达载体（p LVX-Tight-Puro-BPI-LL-37）构建成功;Western blot检测结果表明融合蛋白r BPI21-LL37/LL37-r BPI21能被真核细胞A549细胞表达,融合蛋白大小介于25～30×10^3;抑菌试验进一步验证此融合蛋白具有抑制细菌生长的生物学效应。结论构建的两种r BPI21-LL37/LL37-r BPI21表达载体能够成功转染入人的体细胞,并表达和分泌具有抗菌活性的融合蛋白,该融合蛋白有潜力成为治疗脓毒症的新药。
- 袁培淞朱明郭韡邢伟李向云何静梁华平蒋东坡徐祥黄宏
- 关键词：抗菌蛋白融合蛋白抗菌脓毒症
