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王林: 作品数：12 被引量：15H指数：3; 供职机构：福建医科大学更多>>; 发文基金：福建省重大科技项目福建省高等学校科技创新团队培育计划国家自然科学基金更多>>; 相关领域：医药卫生更多>>

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小分子乙型肝炎病毒基因组缺失突变体结构分析被引量：1: 2008年; 目的了解小分子HBV基因组缺失突变体的基因结构及特点。方法采用一步法PCR从慢性乙型肝炎患者血清中扩增全基因组HBVDNA，回收并克隆〈1kb的小分子HBVDNA，测序并以BioEdit及VectorNTI6．0软件分析基因结构特点。结果获得基因长度介于174～986bp之间的64种、共124个小分子HBV缺失突变体DNA，按基因结构特点分为3类，即3种GT-AG剪接变异体、29种“常规”缺失突变体及32种基因组内部含polyA的缺失突变体。所有小分子基因组缺失突变体在HBV各编码区及基因调控区均存在不同程度缺失，其中66％（42／64种）保留与HBV复制（包装）相关的所有顺式调控序列，48％（31／64种）保留X编码区。结论乙型肝炎患者血清中普遍存在小分子HBV基因组缺失突变体，深入了解这些变异体的结构和功能，有助于进一步探索HBV的致病机制。; 郭丹华王林黄清玲林万松陈婉南林旭; 关键词：肝炎病毒乙型基因缺失聚合酶链反应

乙型肝炎病毒在HepG2细胞中的稳定复制及表达: 2007年; 目的建立HBV HepG2肝细胞株,使HBV能长期稳定地表达抗原并复制。方法将含完整转录单位的1.2倍体HBV DNA经Sal (?)位点克隆入真核表达载体pREP10,构建的重组载体pREP-HBV以Lipofectamine2000转染HepG2细胞,250μg/mL潮霉素筛选抗性细胞克隆。ELISA检测细胞上清液中的HBsAg和HBeAg。电子显微镜下观察细胞上清液HBV颗粒。制备HBV特异性探针,以Southern印迹法检测细胞株内HBV核心颗粒DNA。结果获得含1.2倍体HBV DNA的重组载体,即pREP-HBV,该重组载体转染HepG2细胞后,获得5株潮霉素抗性细胞RHBV1～RHBV5,均能表达HBsAg和HBeAg。Southern印迹结果显示各株细胞均可见明显的杂交拖带,即存在HBV DNA复制中间体。细胞培养上清液浓缩后在电子显微镜下可见成簇的、直径约42 nm的HBV颗粒及直径为22～26 nm的球形颗粒。结论成功建立了HBV稳定复制及表达的HepG2细胞株,目前细胞已传代50次,每3天1次。; 黄清玲柏世玉王林陈婉南林建银林旭; 关键词：转染病毒复制

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响被引量：2: 2008年; 目的研究双剪接型2，2kb乙型肝炎病毒（HBV）剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响。方法PCR扩增6种HBV启动子／增强子序列，以Kpn I及Xho I位点克隆于pGL3-basic，分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP（含HBV基本核心启动子）、pGL3-CP1601（含增强子Ⅱ的核心启动子）、pGL3-XP（X基因最小启动子）、pGL3-XP1071（含增强子I的X基因启动子）、pGL3-SP1（表面抗原大蛋白基因启动子）、pGL3-SP2（表面抗原中蛋白基因启动子）。以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1／HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1／HisC分别与6种HBV启动子／增强子报告载体共转染Huh7细胞，转染后48h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性，实验重复5次，数据以SPSS11.5软件分析。结果在一定的质量比值范围内，与pcDNA3.1／HisC空白载体对照相比，pcDNA3.1／HisC-TPds分别与pGL3，CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后，Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高，而pcDNA3.1／HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后，胞内荧光素酶活性无变化。结论TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子I、Ⅱ，对基本核心启动子和X基因最小启动子无影响。; 陈婉南陈金烟王林林万松林建银林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 RNA剪接反式激活增强子

乙型肝炎病毒458nt-1308nt剪接特异性蛋白抗α-干扰素作用被引量：2: 2008年; 目的研究乙型肝炎病毒（HBV）458nt-1308nt剪接特异性蛋白TSR′r′（源于HBVDNA聚合酶读码框，T代表TP区，S为Spacer区，R′为截短的RT区，r′为截短的RNaseH区）抗α-干扰素（IFN-α）作用并分析其功能区域。方法PCR扩增获得HBV458nt-1308t剪接变异体剪接特异性基因TSR′r′及其缺失突变体，并克隆于pcDNA3.1／HisC。重组载体以FuGENE6转染Huh7肝细胞，通过融合表达的多肽表位抗体，Western blot检测目的蛋白表达。TSR′r′及其缺失突变体重组载体分别与IFN-α反应报告载体p6-16CAT共转染Huh7肝细胞，转染后48h给予终浓度为100IU／ml的IFN-α2a刺激，作用24h后裂解细胞，检测胞内氯霉素乙酰基转移酶（CAT）含量。所有实验数据采用单因素方差分析法进行统计分析。结果构建TSR′r′及其缺失突变体重组真核表达载体，Western blot显示各基因片段在Huh7细胞中均表达相应蛋白。06-16CAT共转染结果显示，随着TSR′r′重组表达载体转染量的递增，Huh7胞内CAT值逐渐降低。此外，转染TP＋Spacer区的缺失突变体可导致Huh7胞内CAT值显著下降，而其他各类TSR′r′缺失突变体共转染后胞内CAT值无变化。结论HBV458nt-1308nt剪接特异性蛋白抑制Huh7细胞对IFN-α的反应性，其活性与N端的TP及Spacer区有关。; 王林黄清玲郭丹华陈婉南林建银林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 RNA剪接 Α-干扰素 DNA聚合酶

乙型肝炎病毒X蛋白对MMPs及TIMPs的影响: 2007年; 目的全面分析乙型肝炎病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)对基质金属蛋白酶(Matrix Metallo-proteinases,MMPs)及组织金属蛋白酶抑制物(Tissue Inhibitors of Metalloproteinases,TIMPs)的影响,探讨其在肝细胞癌的侵袭转移中的可能作用。方法PCR扩增HBVX基因并克隆入真核表达载体pcDNA3.1/HisC,重组载体及空载体分别以Lipofectamine2000转染HepG2细胞并以800μg/mlG418筛选抗性细胞克隆。以Western blot检测抗性细胞HBx表达。抽提细胞总RNA,半定量RT-PCR检测MMPs及TIMPs。收集细胞培养液上清,以明胶酶谱检测MMP2及MMP9活性,反相明胶酶谱检测TIMPs活性。结果构建了HBx重组载体pcDNA3.1-XB。该重组载体及对照空载体转染HepG2细胞后,G418筛选,分别获得抗性细胞克隆HepG2-XB及HepG2-HIS,前者经Western blot证实可表达HBx。半定量RT-PCR显示HBx可促进MMP2、7、13、14、16、17、19、23、24及TIMP1、4基因的转录,抑制MMP1、3、8、9、10、11、12、15、20及TIMP2、3基因的转录。明胶酶谱检测显示HBx可促进酶原MMP2(Pro-MMP2)及活性MMP9(Active-MMP9)表达,抑制酶原MMP9(Pro-MMP9)表达;反相明胶酶谱显示HBx可促进TIMP1、TIMP4的表达,同时抑制TIMP2及糖基化TIMP3的表达。结论HBx蛋白对MMPs、TIMPs转录表达的影响是多方面的,但这种影响在HBx促进肝癌细胞侵袭转移过程中的确切机制有待进一步阐明。; 柏世玉黄清玲李晖王林郑瑾林建银林旭; 关键词：乙型肝炎病毒基质金属蛋白酶组织金属蛋白酶抑制物

458nt～1308nt乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对Huh7细胞基因表达的影响被引量：3: 2009年; 目的研究458nt^1 308nt乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白TSR′r′对Huh7细胞基因表达的影响,探讨其可能的致病机制。方法PCR扩增TSR′r′编码序列并克隆入pcDNA3.1/HisC。以FuGENE6将重组表达载体及相应空载体分别瞬时转染Huh7细胞,Trizol抽提细胞总蛋白与总RNA;以融合表达多肽表位抗体为一抗,Western blot检测目的蛋白的表达;用Affymetrix Genechip U133 plus 2.0人类基因表达谱芯片检测Huh7肝细胞基因转录的变化,并以半定量RT-PCR进一步验证。结果成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1/HisC-TSR′r′,转染48 h后在Huh7细胞中表达TSR′r′蛋白。TSR′r′导致Huh7细胞载脂蛋白H等27个基因转录上调,其中包括5种代谢相关基因,7种免疫相关基因,7种胶原及胞外基质基因,5种干扰素诱导蛋白基因;TSR′r′还导致Huh7细胞核受体共激活物1基因在内的7种基因转录下降。结论458nt^1 308nt乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白可能多方面影响肝细胞功能,具有重要的致病意义。; 黄连真王林陈金烟林万松林建银林旭; 关键词：RNA剪接

双剪接型2．2 kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体编码蛋白的反式激活作用被引量：5: 2006年; 目的研究双剪接型2．2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体编码的新蛋白的功能。方法PCR扩增双剪接型2．2kb HBV剪接特异性新基因并克隆于哺乳动物细胞表达载体pcDNA3．1/ HisC。以FuGENE6将此重组载体(pcDNA3．1/HisC-TPds)转染Huh7细胞,采用融合表达的多肽表位(X- press表位)抗体,通过Western blot检测目的蛋白在不同时间段的表达。pcDNA3．1/HisC-TPds分别与β-半乳糖苷酶报告载体psv-β-galactosidase(含SV40启动子/增强子)或pCMVβ(含CMV即刻早期启动子)共转染Huh7细胞,转染后48h裂解细胞并检测胞内β-半乳糖苷酶活性,实验数据以SPSS11．5软件分析。结果克隆420bp双剪接型2．2kb HBV剪接变异体新基因,Western blot显示其在Huh7细胞中表达相应蛋白,以转染后48h为最高。在含有CMV即刻早期启动子或SV40启动子/增强子的报告载体与pcDNA3．1/HisC-TPds质量比为1：10～1：50范围内,共转染有报告载体及pcDNA3．1/HisC-TPds的Huh7细胞内β-半乳糖苷酶活性均大于相应的pcDNA3．1/HisC空白载体对照组,且在1：10～1：40范围内存在剂量-效应关系。结论双剪接型2．2kb HBV剪接变异体编码的新蛋白可反式激活CMV即刻早期启动子及SV40启动子/增强子,提示其可能与HBV致病有关。; 陈婉南黄清玲林建银王林郭丹华林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 RNA剪接反式激活

乙型肝炎病毒Tp相关蛋白抗干扰素作用研究: 乙型肝炎病毒/(hepatitis B virus, HBV/)是一种部分双链环状嗜肝DNA病毒,宿主范围狭窄,主要是灵长类中的人类和大猩猩。HBV在人类可引起急、慢性乙型肝炎、肝纤维化、并与原发性肝细胞癌的发生发展关系...; 王林; 关键词：乙型肝炎病毒 Α-干扰素 RNA剪接缺失突变; 文献传递

乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白抗α-干扰素功能区域分析被引量：6: 2007年; 目的确定乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶末端蛋白(terminal protein,TP)抗α-干扰素(IFN-α)的功能区域。方法PCR扩增IFN-α诱导人类6-16基因启动子并克隆入pCAT-Basic中,构建IFN-α反应报告载体p6-16CAT。以FuGENE6转染该报告载体至Huh7细胞并给予不同浓度IFN-α2a刺激,ELISA法检测细胞内氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的表达,建立Huh7细胞对IFN-α反应强弱的定量判定标准。构建TP(包括Spacer区)基因缺失突变体重组真核表达载体,通过融合表达的多肽表位抗体,Western blot法检测目的蛋白在Huh7细胞中的表达。重组表达载体分别与报告载体p6-16CAT共转染Huh7细胞,转染后48 h给予终浓度为100 IU/ml的IFN-α2a刺激,作用24 h后裂解细胞,通过检测胞内CAT含量高低评价各缺失突变体抗IFN-α作用,并据此确定TP(包括Spacer区)抗IFN-α作用的功能区域。结果获得6-16基因启动子并构建IFN-α反应报告载体p6-16CAT。转染p6-16CAT的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下CAT表达显著增强,且在IFN-α2a终浓度为100 IU/ml时达到最大。West- ern blot显示TP(包括Spacer区)各基因缺失突变体在Huh7细胞中表达相应蛋白。共转染p6-16CAT及部分/全长TP的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下,胞内CAT值和对照组相比无显著差别,相反,全长TP+部分/全长Spacer使细胞内CAT值显著下降。结论DNA聚合酶Spacer区与HBV抗IFN-α作用密切相关。; 王林柏世玉陈婉南李晖林建银林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 Α-干扰素 DNA聚合酶

乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白抗α-干扰素功能区域分析: 乙型肝炎病毒/(Hepatitis B Virus, HBV/),可引起由无症状病毒携带、急慢性肝炎、肝硬化至肝癌的一系列病变。α-干扰素/(Interferon-α, IFN-α/)是目前最常用的治疗乙型肝炎的药物之一...; 王林; 关键词：乙型肝炎病毒 DNA聚合酶 Α-干扰素; 文献传递

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