闫克夏
- 作品数：9 被引量：43H指数：4
- 供职机构：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- SARS-CoV N蛋白与人冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-229E的交叉反应表位及特异表位的确定被引量：1
- 2006年
- 为确定SARS-CoV N蛋白的特异抗原表位，对3种人冠状病毒SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229EN蛋白之间的交叉免疫反应进行了系统研究。构建了分别表达SARS-CoV、HCoV—OC43和HCoV-229EN蛋白的重组痘苗病毒，并制备了相应的小鼠免疫血清。用间接免疫荧光方法，检测了3种N蛋白的表达及其与3种冠状病毒免疫动物血清和SARS病人恢复期血清之间的反应。与此同时，用Western blot方法分析了原核表达的39个不同区段的SARS-CoVN蛋白与3种冠状病毒动物免疫血清和SARS病人恢复期血清之间的交叉反应性。免疫荧光检测结果表明，SARS-CoV、HCov-OC43和HCoV-229E3种病毒的N蛋白在重组痘苗病毒感染的HeLa细胞中均可以特异表达；3种N蛋白之间存在明显交叉免疫反应。Western blot结果显示，SARS-CoV N蛋白的表位主要位于30～60aa、170～184aa、301～320aa和360～422aa；与HCoV-OC43的交叉反应表位主要位于30～60aa、90～120aa、204～214aa和320～360aa；与HCoV-229E的交叉反应表位主要位于30～60aa、150～160aa和301～360aa。含SARS-CoVN蛋白特异表位的重组肽N155b（60～214aa）和N185（30～214aa）只与SARS病人恢复期血清和灭活SARS-CoV免疫小鼠的血清反应，而不与灭活HCoV-OC43和HCoV-229E免疫的山羊血清产生交叉反应。上述结果为使用SARS-CoVN蛋白抗原进行特异诊断试剂的研究，提供了重要的实验依据。
- 闫克夏谭文杰张相民王慧娟张陵林周为民夏宁邵阮力
- 关键词：SARS-COVN蛋白抗原表位
- 细胞周期蛋白依赖激酶K4在石英致人细胞恶性转化中的作用被引量：4
- 2004年
- 目的 探讨细胞周期蛋白依赖激酶K4(CDK4)在石英致人胚肺成纤维细胞(2BS)恶性转化过程中所起的作用,为石英致癌机制提供理论依据。方法 用基因重组和基因导入的方法将表达反义CDK4 RNA的pXJ41-CDK4导入石英恶性转化的2BS细胞中。采用原位杂交和免疫组化方法检测细胞中CDK4基因表达情况,分析反义CDK4 RNA导入前后,细胞生长速度、倍增时间、细胞周期分布、软琼脂克隆形成能力的改变。结果 石英诱导2BS细胞恶性转化过程中CDK4基因过表达,CDK4基因mRNA表达水平的平均灰度值由26.58±4.78增加到303.47±72.39,蛋白表达水平平均灰度值由28.37±6.09增加到255.82±28.33;反义CDK4 RNA可抑制石英恶性转化细胞的生长增殖,CDK4基因mRNA表达从303.47±72.39降至43.73 4±10.12,蛋白表达从255.82±28.33降至41.92±3.25。与石英恶性转化细胞相比,反义pXJ41-CDK4转染细胞培养至第8天时,生长速率下降77.43％;倍增时间从21.0 h延长到42.7 h;G1期细胞比例从45.1％增加到58.0％,S期由40.3％下降到30.0％;克隆形成率明显下降,且克隆明显变小。结论 CDK4的异常表达与石英恶性转化细胞有密切的关系,高水平表达的CDK4对维持恶性转化细胞的恶性性状起重要的作用。
- 闫克夏刘秉慈史香林张相民尤宝荣徐茗康宁
- 关键词：CDK4恶性转化细胞细胞周期蛋白依赖激酶基因MRNA表达人细胞
- CyclinD1与CDK4在石英致人细胞恶性转化中作用的研究
- 为研究石英诱导人细胞恶性转化过程中cyclinD1和CDK4表达水平的改变规律及其生物学意义,我们采用反义RNA技术进行了下列研究:1.构建正义pXJ41-cyclinD1、反义pXJ41-cyclinD1及反义pXJ4...
- 闫克夏
- 关键词：CDK4石英反义RNA细胞恶性转化
- 文献传递
- 细胞周期蛋白D1在石英致人细胞恶性转化中的作用被引量：4
- 2004年
- 目的探讨细胞周期蛋白D1在石英致人胚肺成纤维细胞(HELF)恶性转化过程中所起的作用。方法采用基因重组与基因导入的方法将表达正义和反义细胞周期蛋白D1RNA的pXJ41细胞周期蛋白D1导入石英恶性转化HELF细胞中。采用原位杂交和免疫组化的方法检测细胞中细胞周期蛋白D1基因表达情况,分析细胞周期蛋白D1导入前后细胞生长速度、倍增时间、细胞周期分布、软琼脂克隆形成能力的改变。结果石英诱导HELF细胞恶性转化过程中细胞周期蛋白D1基因过表达,反义细胞周期蛋白D1RNA可抑制石英恶性转化细胞的生长增殖。与石英恶性转化细胞相比,反义pXJ41细胞周期蛋白D1转染细胞培养至第8天时,生长速率下降5869%,倍增时间从210h延长到314h,G1期细胞比例从451%增加到527%,S期细胞比例由403%下降到331%,克隆形成率显著下降,克隆明显变小。结论细胞周期蛋白D1的异常表达与石英恶性转化细胞有密切的关系,高水平表达的细胞周期蛋白D1对维持恶性转化细胞的恶性性状起重要的作用。
- 闫克夏刘秉慈史香林尤宝荣徐茗康宁赵超英
- 关键词：细胞周期蛋白D1石英细胞恶性转化原位杂交
- 抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的特异性及其识别抗原表位的初步鉴定被引量：4
- 2006年
- 为了明确抗SARS-CoVN蛋白单克隆抗体的特异性,并鉴定其识别表位,首先在E.coli中表达了人类冠状病毒229E(HCoV-229E)和OC43(HCoV-OC4)N蛋白,用Westernblotting和间接免疫荧光方法分别检测了4株抗SARS-CoVN蛋白单克隆抗体(1-1C2、1-1D6、2-8F11和2-2E5)与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白的交叉反应情况,而后应用12种重组截短型SARS-CoVN蛋白对上述4种单克隆抗体的识别表位进行了初步定位。结果显示:(1)在4株抗N蛋白单克隆抗体中,1-1C2、1-1D6和2-2E5不与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白发生交叉反应,为SARS-CoVN蛋白特异性抗体;(2)2-8F11、1-1D6和2-2E5针对的抗原表位位于SARS-CoVN蛋白的aa30-60,1-1C2针对的抗原表位则位于SARS-CoVN蛋白的aa170-184。这一研究为阐明SARS-CoVN蛋白的免疫学特征,建立特异性免疫诊断技术和研究其致病机制提供了必要的依据和材料。
- 王健伟王彦斌常昭瑞闫克夏谭文杰屈建国夏宁邵阮力洪涛
- 关键词：核衣壳蛋白抗原表位
- 正反义细胞周期蛋白D1真核表达载体的构建与鉴定被引量：4
- 2003年
- 用基因导入和基因重组技术将外源基因细胞周期蛋白D1(cyclinD1)cDNA插入到真核表达载体pXJ41 neo上 ,并用电泳鉴定其结果。结果显示 :用HindIII酶切 ,出现 2 2 9bp、42 7bp及 75 5 4bp片段的重组体为正义pXJ41 cyclinD1真核表达载体 ;出现 42 7bp、1184bp及 65 99bp片段的重组体为反义pXJ41 cyclinD1真核表达载体 ,与理论分析结果相同。表明已成功重组和鉴定了正反义pXJ41 cyclinD1真核表达载体。
- 闫克夏刘秉慈徐茗尤宝荣康宁
- 关键词：真核表达载体基因重组技术反义技术肿瘤
- 密码子偏性对痘苗病毒载体表达效率影响的研究被引量：5
- 2006年
- 为了研究密码子偏性对痘苗病毒载体表达效率的影响,分别采用痘苗病毒及其宿主细胞的优势密码子对绿色荧光蛋白基因进行改造,利用荧光、Western blot和FCM等方法分析其在痘苗病毒载体系统的表达水平。结果显示,全部采用痘苗病毒优势密码子(富含A+T)和全部采用宿主细胞优势密码子(富含G+C),以及部分使用宿主细胞优势密码子的三种绿色荧光蛋白基因都能够有效表达,表达水平相近,表明痘苗病毒载体对目的基因密码子的使用具有很好宽容性。为了探讨这种宽容性的机理,分别利用在胞核内和在胞浆内转录的质粒载体对不同密码子偏性的绿色荧光蛋白基因进行表达分析。结果显示,胞核内转录目的基因的pcDNA3质粒载体能有效表达富含G+C的绿色荧光蛋白基因,不能有效表达富含A+T的绿色荧光蛋白基因,而胞浆内转录目的基因的pSCA质粒载体能同样有效表达上述不同密码子偏性的目的基因。这些结果表明,位于胞浆内的富含A+U的转录产物能够有效表达,细胞核内生成的富含A+U的转录产物可能受核膜屏障或其它核内因素影响而不能有效表达。因此,胞浆内繁殖的特性是痘苗病毒载体具有密码子宽容性的主要原因。此研究为痘苗病毒载体和常用真核表达载体的选择使用提供了重要实验依据。
- 张相民王世峰辛伟邓瑶李仁清闫克夏齐香荣高瑛瑛谭文杰鲁宁孟昕阮力
- 关键词：密码子偏性痘苗病毒载体基因表达
- SARS-CoV假病毒中和试验技术的建立及评价被引量：17
- 2007年
- 为避免传统的SARS病毒中和试验需要操作活毒而存在的生物安全隐患,建立了基于假病毒系统、操作较安全的SARS中和试验技术平台。本研究应用高效表达SARS-CoV S(密码子优化的全长S蛋白,简称S)的真核表达载体(pVRC8304),与HIV慢病毒包装质粒(p CMV△8.2)及转移质粒(pHR′CMV EGFP)3个质粒载体系统共同转染人胚肾细胞293T,包装了SARS假病毒;通过SARS假病毒感染的RD-A细胞中标记基因EGFP表达的分析,确定SARS假病毒能有效进入细胞,建立了可在BSL-2级实验室操作的SARS病毒中和试验技术平台。用该技术平台对不同免疫血清进行了中和抗体分析,并比较了基于假病毒和基于SARS活病毒的中和试验效果。结果显示:SARS假病毒和SARS活病毒两个中和试验系统获得中和抗体滴度变化趋势一致,表明本研究构建的SARS假病毒可替代SARS活病毒用于建立操作上安全的SARS病毒中和试验技术平台。
- 闫克夏谭文杰张相民王慧娟李岩阮力
- 关键词：SARS-COVS蛋白假病毒
- HIV-1 tat基因改造及其蛋白表达、纯化与抗体制备被引量：7
- 2006年
- 目的:为了方便实验室工作中HIV-1B'/C亚型及C亚型Tat蛋白的检测,制备了相应的Tat蛋白及其抗体。方法:将我国HIV-1B'/C亚型流行株tat基因的第1个外显子和HIV-1C亚型tat基因的第2个外显子融合在一起,将密码子替换为大肠杆菌的优势密码子,通过合成引物、PCR拼接的方法,获得目的基因序列;在原核系统中与pET32a+载体中的His·Tag、Trx·Tag及S·Tag进行融合表达;目的蛋白经Ni+金属螯合层析柱纯化后,用于免疫家兔,制备多克隆抗体。结果:PCR拼接获得306bp的目的基因序列;在原核系统中融合表达得到相对分子质量约31000的融合蛋白,占菌体总蛋白的21%。纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白反应良好;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型和C亚型的Tat蛋白都能产生特异性反应。结论:制备的多克隆抗体能够使用间接免疫荧光方法检测HIV-1C亚型的Tat蛋白,使用Western印迹方法和间接免疫荧光方法都能检测HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白。
- 齐香荣张相民高瑛瑛邓瑶闫克夏李仁清阮力
- 关键词：HIV-1TAT基因TAT蛋白
