马寅姣
- 作品数：8 被引量：33H指数：3
- 供职机构：中国药科大学生命科学与技术学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省科技支撑计划项目中央高校基本科研业务费专项资金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 抗生素筛选方法被引量：3
- 2010年
- 细菌耐药性发生率的升高,激励着人们去寻找更多的筛选抗生素的策略,进而发现了更多的抗生素作用机制。靶向策略、高通量筛选等方法已经被用于检测有潜力的抗生素。细菌的DNA复制、细胞分裂和蛋白合成的中间步骤已经成为了筛选的新靶点,双组分信号传递系统也成为了较为重要的药物新筛选靶点。微生物基因组学的发展,给新抗生素的发现带来了更大的希望,使人们可以发现更多的新作用靶点。
- 马寅姣宋沁馨顾觉奋
- 关键词：抗生素基因组
- 基于核酸侵入反应的生物分子检测技术的研究进展被引量：3
- 2011年
- 核酸侵入反应是由5'核酸内切酶或flap内切酶催化的,能够识别切割核酸片段形成的特异性结构的一类反应。近年来发展了很多基于该反应的生物大分子检测技术,能够对DNA、RNA、miRNA及蛋白质进行高灵敏、高特异性的测定。这些技术大都无需扩增待测靶标,极大地降低了扩增产物交叉污染的风险,在临床检测中具有很大的应用前景。本文对这些检测技术的原理及应用作简要综述。
- 马寅姣邹秉杰王建平周国华
- 重组丙酮酸磷酸双激酶与荧光素酶偶联催化ATP-AMP循环反应被引量：1
- 2008年
- 丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate phosphate dikinase,PPDK;EC 2.7.9.1)能够可逆催化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)、单磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)和焦磷酸盐(pyrophosphate,PPi)生成三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)、无机磷酸盐(orthophosphate,Pi)和丙酮酸(pyruvate).以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到了编码PPDK的基因,将此基因片段插入表达载体pET24a(+),在大肠杆菌中表达C端融合His-Tag的重组PPDK.与我们先前表达的N端融合His-Tag的PPDK相比,酶的活性提高了20倍,提示该酶的N端对活性十分重要.重组PPDK单体分子量为98 kD.经过镍亲和层析和超滤后,重组PPDK基本达到电泳纯.重组PPDK与荧光素酶偶联能够形成1个ATP-AMP循环反应,在该循环反应中,荧光素酶催化ATP生成的AMP和PPi能够被PPDK重新转化成ATP,产生一个持续稳定的信号.
- 邹秉杰陈颖马寅姣周国华
- 关键词：丙酮酸磷酸双激酶
- 热稳定生物素化荧光素酶的制备及其在焦测序中的应用被引量：5
- 2010年
- 新一代大规模焦测序技术需要稳定的可固定化的荧光素酶,为了制备热稳定性好且被生物素化的荧光素酶,本研究采用基因工程方法将生物素羧基载体蛋白C端87个氨基酸残基(BCCP87)与荧光素酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行融合表达,以实现菌体内直接表达生物素化的荧光素酶(BCCP-LUC);并对北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因进行了定点突变以增强其热稳定性;用链亲和素包被的磁珠对重组融合蛋白进行固定化,用于焦测序。实验结果表明:突变后的荧光素酶在50℃环境中仍具有活性;在43℃下10min活性保留大于80%,热稳定性明显增强。Western blot分析结果表明,荧光素酶能够在大肠杆菌内生物素化。用链亲和素包被的磁珠结合BCCP-LUC后具有较高活性(2.1×105RLU/μL Beads),经过多次洗涤活性无明显下降。采用微球固定的荧光素酶以及ATP硫酸化酶成功的进行了DNA序列的测定且定量准确,表明固定化的荧光素酶可以应用于焦测序中,为建立高通量大规模芯片焦测序技术提供有效、稳定的工具酶。
- 朱术会邹秉杰武海萍马寅姣陈颖周国华
- 利用ATP扩增反应与生物发光法结合检测微量微生物被引量：8
- 2009年
- 【目的】腺苷酸激酶(adenylate kinase,ADK)和多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK)偶联催化的ATP扩增反应结合生物发光检测法能够对微量微生物进行检测。但是PPK当中结合的内源性的ADP会产生背景干扰,影响测定。本文旨在融合表达ADK和PPK,并建立一种方便有效的内源性ADP的去除方法,降低背景,使之与传统生物发光法结合,实现高灵敏生物发光法检测微量ATP及微生物。【方法】PCR扩增得到PPK、ADK基因,插入表达载体pET28a(+)中构建重组表达质粒pET28a(+)-PPKADK,表达PPK-ADK融合蛋白。利用表面包裹聚胺醇(Polyurethane)的磁珠(magnetic beads),通过化学反应将腺苷酸双磷酸酶(apyrase)固定于磁珠表面,制备固相腺苷酸双磷酸酶(Beads-apyrase),用于除去与融合蛋白结合的内源性ADP,降低ATP扩增反应的背景,从而使之与生物发光反应相结合,测定微量外源ATP及细菌菌落数。【结果】表达的融合蛋白具有PPK和ADK的活性,利用Beads-apyrase可以方便而有效的去除内源性ADP,显著地降低反应背景,从而实现了利用ATP扩增反应与传统生物发光反应结合,测定了小于1fmol的外源微量ATP,使生物发光法检测ATP及微生物的灵敏度提高至少100倍。【结论】利用Beads-apyrase能够方便、有效地降低PPK-ADK中的ADP背景,从而使PPK-ADK催化的ATP扩增反应能够与传统生物发光法相结合,极大地提高了生物发光法的灵敏度。
- 陈颖邹秉杰朱术会马寅姣周国华
- 关键词：腺苷酸激酶
- 单管高灵敏度等温扩增技术快速检测甲型H1N1流感病毒被引量：11
- 2011年
- 建立了单管逆转录环介导等温扩增法(RT-LAMP)快速检测甲型H1N1流感病毒的方法。针对甲型H1N1流感病毒的M基因和HA基因的保守区,设计了两组特异性引物,分别用于筛选甲型流感病毒及鉴定甲型H1N1流感病毒。对反应体系中的关键因素进行优化,反应结果可直接通过浊度或者SYBR GreenⅠ荧光进行判定。本方法最低可检测到10拷贝/管的甲型H1N1流感病毒。为验证方法的可行性,对30例临床样本进行了检测,与美国疾病控制与预防中心(CDC)的TaqMan方法进行对比,检测的灵敏度和特异性分别为92%和100%。本方法实现了单管快速检测甲型H1N1流感病毒,为甲型H1N1流感病毒的现场检测提供了新方法。
- 成思佳陈之遥初亚男崔仑标史智扬马寅姣周国华
- 关键词：甲型H1N1流感病毒SYBR
- 重组大肠杆菌单链结合蛋白性质表征及其在提高焦磷酸测序准确性中的应用被引量：1
- 2011年
- 利用基因工程手段表达了分子量约为24 kDa的重组大肠杆菌单链结合蛋白(r-SSBP),通过凝胶阻滞电泳与DNA熔解温度(Tm)影响实验表征了r-SSBP与单链DNA(ssDNA)结合的特性,结果表明,r-SSBP可以与ssDNA结合,并且能够降低DNA的Tm值,同时还能增大含有单个错配碱基的DNA与完全匹配的DNA的Tm值差异,这一特性在提高单核苷酸多态性检测的特异性方面具有潜在的应用价值。此外,将r-SSBP应用于本课题组开发的高灵敏度焦磷酸测序体系中测定已知序列ssDNA模板,结果表明,r-SSBP能够有效降低非特异信号,改善信号峰比例,提高焦测序的准确度,为完善高灵敏度焦磷酸测序体系奠定了基础。
- 王建平邹秉杰陈之遥马寅姣徐澍周国华
- 关键词：大肠杆菌焦磷酸测序
- 重组flap核酸内切酶1的表达及活性测定方法的建立被引量：3
- 2016年
- Flap核酸内切酶1(Flap endonuclease 1,FEN1)是一种能催化核酸侵入反应的核酸内切酶,可应用于信号放大检测方法,但该酶详细的表达纯化工艺尚无报道,并且活性难以准确测定,限制了其应用。通过合成嗜热古球菌Archaeoglobus fulgidus来源的FEN1基因序列,构建了p ET24a(+)-FEN1-His重组质粒,并通过优化表达条件,得到了FEN1最优表达条件为:37℃、200 r/min振荡培养8 h后,加入诱导剂IPTG至终浓度为0.05 mmol/L,再于37℃、200 r/min诱导表达11 h,最终经镍亲和层析成功纯化得到了分子量约为38 k Da的重组FEN1。同时建立了基于荧光标记探针的FEN1活性测定方法,准确测定了重组FEN1的活性,为建立基于该酶的核酸检测方法提供了可靠的酶活力依据。最终将重组FEN1用于实时荧光PCR偶联高特异核酸侵入信号扩增法检测了乙醛脱氢酶2基因(aldh2)的基因型,得到了准确的分型结果,表明重组FEN1能用于基因多态性的分型检测中,为发展基于核酸侵入反应的核酸检测方法提供了可靠的工具酶。
- 盛楠马寅姣王建平邹秉杰周国华
- 关键词：信号放大活性测定
