- 大鼠Uqcrfs1重组质粒的构建及其在HEK293T细胞中的表达
- 2012年
- 目的:构建大鼠Uqcrfs1的重组质粒并检测其在人胚胎肾293T细胞中的表达。方法:应用RT-PCR方法从大鼠肾脏组织总RNA中扩增出编码Uqcrfs1的cDNA,克隆至pUM-T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,酶切鉴定及测序正确后以磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK 293T细胞,使用RT-PCR、Western Blot方法检测重组质粒在转录及蛋白水平的表达。结果:测序结果证实PCR扩增得到编码Uqcrfs1的cDNA序列正确;磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,在基因转录与蛋白表达水平,结果达到预期。结论:成功构建大鼠Uqcrfs1的重组质粒,该重组质粒可在HEK293T中过表达。
- 孙斯凡古艳婷李平王红盼董晞杨靖赵婷婷王旭
- 关键词：重组质粒糖尿病肾病
- 大鼠ETFβ基因过表达对NADPH氧化酶基因表达的影响
- 2012年
- 目的:构建大鼠ETFβ的重组质粒并检测其在人胚胎肾293T细胞中的表达和对NADPH氧化酶的影响。方法:应用RT-PCR方法从大鼠肾脏组织总RNA中扩增出编码ETFβ的cDNA,克隆至pUM-T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,酶切鉴定后测序,测序正确后用磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,使用RT-PCR方法检测空载体组和重组质粒转染组的NADPH氧化酶各亚基mRNA水平的表达变化。结果:(1)测序结果证实PCR扩增得到编码ETFβ的cDNA序列正确;(2)磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,ETFβ融合蛋白成功表达;(3)RT-PCR结果显示重组质粒转染组的NADPH氧化酶5个亚基中的NOX3,NOX4的mRNA表达降低(P<0.05),空载体组和重组质粒转染组之间比较NOX1,NOX2,NOX5的mRNA表达差异无统计学意义。结论:成功构建大鼠ETFβ的重组质粒,该重组质粒可在HEK293T中过表达,并且降低了NADPH氧化酶NOX3,NOX4的mRNA表达水平。
- 古艳婷孙斯凡李平董晞王红盼赵婷婷张浩军杨靖
- 关键词：NADPH氧化酶HEK293
- EPHX2基因过表达质粒的构建及意义探讨
- 2014年
- 目的:构建LETO、OLETF大鼠EPHX2基因过表达重组质粒,观察其在人胚肾细胞(human embryonic kidney293T,HEK293T)中的表达,及对HEK293T细胞NF-κBp65 mRNA表达的影响。方法:提取LETO、OLETF大鼠肾脏组织总RNA,RT-PCR方法扩增编码EPHX2基因的cDNA,克隆至T-载体并测序,经亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,构建两型大鼠EPHX2过表达重组质粒,酶切鉴定并测序,采用磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞系。Western Blot方法检测EPHX2融合蛋白的表达,RT-PCR方法检测EPHX2基因过表达对HEK293T细胞NF-κBp65表达水平的影响。结果:(1)两个重组质粒均含有完整EPHX2 cDNA,测序证实OLETF型大鼠较LETO型大鼠EPHX2重组质粒有五个核苷酸位点的改变。(2)转染HEK293T细胞后,Western Blot证实融合蛋白成功表达;(3)TNF-α刺激增加HEK293T细胞中NF-κBp65mRNA表达;(4)EPHX2基因过表达促进TNF-α刺激后的HEK293T细胞中NF-κBp65 mRNA表达升高(P<0.05)。结论:成功构建LETO型及OLETF型大鼠EPHX2过表达重组质粒(L-EPHX2/V5、O-EPHX2/V5),可在HEK293T细胞中过表达。为进一步探讨EPHX2基因在糖尿病肾病发生发展中的作用奠定了基础。
- 费敏李平赵婷婷孙斯凡古艳婷王华张浩军杨靖
- 关键词：重组质粒NF-ΚBP65糖尿病肾病
