- SYBR Green I染料real-time RT-PCR检测Rb Ap46基因表达条件的优化被引量：1
- 2005年
- 目的 通过优化反应体系,建立SYBRGreenI染料real timeRT PCR检测RbAp4 6基因表达的方法。方法 构建pUCm Tvector RbAp4 6阳性模板,根据分子量及阿佛加德罗常数(6 .0 2 3×10 2 3 分子数/mol)换算为分子拷贝数,10倍倍比稀释后做标准曲线。根据标准曲线的斜率、相关系数、荧光强度及熔解曲线优化反应体系中各组分的量及反应条件。结果 2 5 μl的反应体系中10×PCR缓冲液2 .5 μl,2 5mmol/LMgCl2 2 .2 μl,10mmol/LdNTPs0 .5 μl,2 0×SYBRGreenI 0 .5 μl,12 .5umol/L引物各0 .5 μl,5U/μlTaqDNA聚合酶0 .3μl,cDNA1μl(相当于5 0ngRNA) ,双蒸水17μl。反应条件为:94℃5min预变性,96℃2 0s变性,5 8℃30s退火,72℃4 5s延伸,4 0个循环,80℃时采集荧光信号,可以获得最好的扩增效率。结论 优化后的SYBRGreenIreal timePCR适合于检测RbAp4 6基因表达,具有比较好的重复性,灵敏度高,特异性强。
- 胡绍燕陈子兴岑建农顾伟英赵晔
- 关键词：实时定量RT-PCRSYBR
