刘邓
- 作品数：12 被引量：50H指数：4
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- 猪流行性腹泻病毒CH/ZJ分离株S基因的克隆、原核表达和免疫原性分析被引量：11
- 2010年
- 为了获得具有免疫活性的猪流行性病毒S蛋白,试验参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株S基因序列设计1对特异性引物,去除信号肽,以PEDVCH/ZJ株为模板,通过RT-PCR扩增出目的基因,克隆入原核表达载体pET28a(+),转化到Top10感受态细胞中,测序并分析。结果表明:目的基因含有1个长966bp、编码322个氨基酸残基组成的多肽;与CV777株相比较,同源性为96.0%,但在398bp处缺失编码1个异亮氨酸的密码子,将重组质粒命名为pET-P-SP1;将pET-P-SP1转化到大肠杆菌E.coliBL21-DL3(Rosetta)中,在IPTG诱导下表达;通过SDS-PAGE表达出与预期大小相符的约35.6ku的重组蛋白,重组蛋白以包涵体形式存在;表达产物占菌体蛋白的80%;表达蛋白能与抗猪流行性腹泻病毒高免血清反应,说明该重组蛋白具有免疫活性。
- 刘邓冉多良袁秀芳徐丽华牛登元张存王朝文王一成
- 关键词：猪流行性腹泻病毒S基因原核表达免疫学活性
- TaqMan荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立与初步应用被引量：22
- 2010年
- 根据GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒Ⅳ基因序列，设计了一对特异性引物和探针，扩增长度为186bp的片段。以克隆Ⅳ基因的质粒作为阳性标准品，建立了一种快速检测猪流行腹泻病毒含量的TaqMan荧光定量PCR方法。该方法在10^9-10^1copies／μL范围内具有良好的线性关系，可检测到初始模板中10copies／μL的质粒DNA，以猪圆环病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒为模板时，均检测不到荧光信号，而重复性实验中其变异系数均小于2％，表明此方法具有很好的特异性和重复性。应用此方法对采集的60份，陆床样品进行检测，其阳性检出率为92％，而用常规RT-PCR方法进行检测，阳性检出率仅为80％。表明荧光定量RT-PCR方法的敏感性明显高于常规PcR检测方法。
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- 关键词：猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR
- 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒
- 本发明公开了猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒。所述检测用引物和探针为序列表SEQIDNO：1至SEQIDNO：6，其中序列SEQIDNO：1和SEQIDNO：2分别为检测猪传染性胃肠炎病毒...
- 袁秀芳王一成徐丽华李军星刘邓
- 文献传递
- 猪传染性胃肠炎诊断技术研究进展被引量：4
- 2008年
- 猪传染性胃肠炎是一种由冠状病毒引起的以仔猪呕吐、腹泻和脱水为特征的传染病,对养猪业造成了巨大的损失。为此,众多学者对该病的诊断与检测方法进行了大量的研究,建立了临床诊断、病原分离等传统诊断方法,以及大量的免疫学、分子生物学诊断方法等。研究猪传染性胃肠炎的诊断与检测方法对防控该病的暴发和传播有重要意义。
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- 关键词：传染性胃肠炎免疫学分子生物学
- 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒多重TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用
- 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起仔猪腹泻和死亡的主要病因之一，本实验根据TaqMan探针荧光定量分析原理，设计两对引物和两条探针，分别以FAM和JOE标记探针。以T7体外转录试剂盒得到的...
- 袁秀芳刘邓徐丽华王一成
- 关键词：猪传染性胃肠炎猪流行性腹泻RT-PCR检测
- 文献传递
- 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒多重TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用
- 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起仔猪腹泻和死亡的主要病因之一,本实验根据TaqMan探针荧光定量分析原理,设计两对引物和两条探针,分别以FAM和JOE标记探针。以T7体外转录试剂盒得到的...
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- 关键词：猪传染性胃肠炎病毒猪流行性腹泻病毒
- 文献传递
- 猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重RT-PCR鉴别方法的建立被引量：12
- 2009年
- 根据GenBank发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Purdue P115株的基因序列,针对其基因保守区,设计1条共用的下游引物和2条各自病毒的上游引物,可特异扩增出大小分别为213 bp和546 bp目的条带。经过对TaqDNA聚合酶和Mg2+浓度、退火温度(Tm)等PCR反应条件的优化,最终确定该双重RT-PCR的最佳条件为TaqDNA聚合酶浓度为0.03 U/μL,Mg2+浓度为0.05 mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,Tm为51℃。特异性和敏感性检测结果显示,所建立的检测方法具有很好的特异性以及较高的敏感性。
- 刘邓袁秀芳徐丽华牛登元王朝文王一成
- 关键词：猪流行性腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒
- 猪腹泻大肠杆菌LTa(R210G)和LTb原核表达及其在小鼠的免疫反应
- 2009年
- 大肠杆菌不耐热性肠毒素(LT)具有免疫增强作用,是良好的免疫佐剂。为了更好的研究其免疫增强效果,本研究将LT的两个亚基LTa(R210G)和LTb克隆到pGST中,原核表达LTa(R210G)和LTb,经Western-blotting分析,表达蛋白具有免疫原性。对表达蛋白进行大量纯化后,以卵清蛋白为模式蛋白(OVA)为模式蛋白,免疫小鼠,ELISA结果表明,OVA+LTa(R210G)佐剂组小鼠的抗体滴度最高,OVA+LTb和OVA+LTa+LT组抗体滴度相似,高于OVA+氢氧化铝组,而OVA+氢氧化铝组高于无佐剂OVA组。因此,LTa(R210G)和LTb具有良好的免疫增强作用,是一种极有希望的免疫佐剂。
- 袁秀芳王一成徐丽华刘邓牛登元王朝文
- 关键词：原核表达免疫反应
- 猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻快速诊断方法的建立及S基因的表达
- 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒同属于冠状病毒，是引起猪腹泻和仔猪死亡的两种主要病原。本研究分别建立了普通双重RT-PCR和双重实时荧光定量RT-PCR鉴别诊断PEDV和TGEV的方法以及实时荧光定量RT-PCR检测...
- 刘邓
- 关键词：猪传染性胃肠炎流行性腹泻RT-PCR检测S蛋白
- 文献传递
- PRRSV浙江株ORF5基因的原核表达与免疫原性分析被引量：1
- 2009年
- 根据GenBank中公布的PRRSV基因序列(EU709837),设计一对PCR引物,以浙江分离株为模板,通过RT-PCR扩增出ORF5基因全序列。以PCR技术构建了缺失信号肽及三处跨膜区的重组ORF5基因,命名为g-ORF5。将g-ORF5基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中,转化入E.coli菌株BL21。经酶切和测序鉴定后,阳性菌株用1 mol/L IPTG诱导表达,用Ni-NTA纯化表达的重组蛋白。结果表明,重组GP5蛋白在大肠杆菌中获得表达。纯化后经ELISA和Dot-ELISA分析,表达蛋白具有免疫反应性,能与PRRSV阳性猪血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。
- 牛登元王一成袁秀芳徐丽华刘邓伏小平
- 关键词：ORF5原核表达
