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问号钩端螺旋体鞭毛蛋白相关蛋白FliH／I／Y／N基因原核表达和膜定位被引量：1: 2008年; 目的克隆问号钩端螺旋体（简称钩体）鞭毛相关蛋白编码基因fliH、fliI、fliY和fliN并构建其原核表达系统，制备表达产物抗血清并了解其蛋白的定位。方法以苯酚-氯仿法提取的问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板，用PCR扩增全长fliH、fliI、fliY和fliN基因片段，T-A克隆后测序，继而构建上述目的基因克隆的原核表达系统。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图像分析系统检查重组蛋白rFliH、rFliI、rFliY和rFliN的表达情况，Ni-NTA亲和层析法提纯目的表达产物。皮下免疫家兔获得4种目的重组蛋白抗血清，用ELISA和Western blot分别检测抗血清效价并了解抗血清与相应抗原结合的能力。采用免疫电镜技术对fliH、fliI、fliY和fliN进行定位。结果PCR扩增获得大小分别为924、1365、1065和318 bp的全长fliH、fliI、fliY和fliN基因片段，与报道的序列比较，其核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％。所构建的原核表达系统均能有效地表达目的重组蛋白，其产量均约为20％。rFliH、rFliI、rFliY和rFliN蛋白免疫家兔后能产生抗体，其兔抗血清ELISA效价达到1：100000以上，并分别识别钩体相应重组蛋白和膜蛋白提取物而出现明显的Western杂交条带。fliH、fliI、fliY和fliN蛋白分布于问号钩体内膜、外膜或内外膜之间。结论本研究成功地构建了能高效表达问号钩体鞭毛相关蛋白fliH、fliI、fliY和fliN的原核表达系统，并获得了能有效识别上述蛋白抗原的高效价抗血清。鞭毛相关蛋白fliH、fliI、fliY和fliN是问号钩体内膜或外膜蛋白成分。; 徐韩飞阮萍廖苏梅杨平毛亚飞李立伟严杰; 关键词：问号钩端螺旋体原核表达

基于问号钩端螺旋体rLipL32／1-LipL21-OmpL1／2融合抗原的ELISAs建立及应用: 2008年; 目的:建立基于问号钩端螺旋体(简称钩体)rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2融合抗原的ELISAs,并应用于检测钩体病患者血清特异性IgG和IgM。方法:采用显微镜凝集试验(MAT),检测钩体病患者血清及rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清对我国问号钩体参考标准株的效价。分别以rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2、rLipL32/1、rLipL21和rOmpL1/2为包被抗原,建立检测血清特异性IgM和IgG的ELISAs,并用于检测107份MAT阳性钩体病患者血清标本。结果:MAT结果证实,66%(71/107)患者感染黄疸出血群问号钩体,rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清对我国15株问号钩体参考标准株的凝集效价为1∶20～1∶160。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2、rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2抗原用于检测IgM的ELISA阳性率分别为89.7%、75.7%、85.1%和79.4%,用于检测IgG的ELISA阳性率分别为99.1%、99.1%、94.4%和86.0%。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2-IgM-ELISA检测阳性率高于其它3种检测IgM的ELISAs(P<0.05),rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2-IgG-ELISA检测阳性率高于rOmpL1/2-IgG-ELISA(P<0.05),但与rLipL21-IgG-ELISA及rLipL32/1-IgG-ELISA接近(P>0.05)。结论:rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2-ELISAs可作为敏感、特异的通用型钩体病血清学早期诊断方法。; 邱晓枫徐韩飞郭宗琪王江严杰

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徐韩飞

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