曲勍
- 作品数：3 被引量：0H指数：0
- 供职机构：复旦大学附属上海市公共卫生临床中心科学研究部更多>>
- 发文基金：上海市青年科技启明星计划国家自然科学基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 分枝杆菌膜锚定表达载体的构建与亚细胞定位分析
- 2011年
- 目的构建分枝杆菌膜锚定表达载体，并分析外源目标蛋白的表达情况及其亚细胞定位。方法在分枝杆菌胞内表达载体pMFA42的基础上进行改造，人工合成结核分枝杆菌（Myco—bacteriumtuberculosis，Mtb）相对分子质量（Mr）为19×10^3的脂蛋白膜分泌信号序列，将其插入高效的突变型furA基因启动子（pfurAma）下游构建新型的分枝杆菌膜锚定表达载体pMFA42M。PCR扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码基因，亚克隆至上述两种载体中并电转化耻垢分枝杆菌（Mycobacte—riumsmegmatis，Ms），分别获得重组EGFP融合表达菌株和膜锚定表达菌株；接着将Mtb主要保护性抗原Ag85A及其嵌合抗原Ag856A2的编码基因亚克隆入膜锚定表达载体pMFA42M中构建Mtb抗原-EGFP融合表达菌株；通过Westernblot和流式细胞表面标记技术来分析目标抗原的表达水平及其亚细胞定位，并进一步通过荧光显微镜直接观察重组EGFP融合表达菌株在体外和感染巨噬细胞后的荧光强度。结果通过引入Mtb19×10^3脂蛋白膜分泌信号，在高效pfurAma启动子的驱动下，成功地构建了分枝杆菌膜锚定表达载体。利用EGFP作为标签抗原，通过Westernblot、荧光显微观察和流式细胞表面标记等技术均证实了外源目标抗原可在分枝杆菌中高水平表达并定位至细胞膜上。结论本研究为重组BCG和分枝杆菌膜蛋白功能研究提供了一种新型的膜锚定表达载体，所构建的EGFP重组表达菌株亦可作为一种模式示踪菌为细胞吞噬和动物免疫中的细菌定植和移位分析提供新思路。
- 王鑫范小勇马辉曲勍
- 关键词：分枝杆菌增强型绿色荧光蛋白亚细胞定位
- 麻风分枝杆菌热休克蛋白65的表达、纯化及其多克隆抗血清的制备
- 2011年
- 目的原核表达、纯化麻风分枝杆菌热休克蛋白65(Heat shock protein 65,HSP65),并制备其多克隆抗血清。方法以含hsp65基因的真核表达质粒pCMV4.65为模板,PCR扩增hsp65基因,克隆入pET-28a(+)载体,构建重组表达质粒pET-28a-hsp65,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗血清,Western blot分析重组蛋白的反应原性。结果重组表达质粒pET-28a-hsp65经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约65 000,表达量约占菌体总蛋白的30%,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达95%,浓度约为1.0 mg/ml;制备的HSP65多克隆抗血清效价可达1∶12 800;重组蛋白具有良好的反应原性。结论已成功表达、纯化了麻风分枝杆菌重组HSP65蛋白,并制备了HSP65多克隆抗体,为进一步研究以HSP65为基础的亚单位疫苗和核酸疫苗奠定了基础。
- 吴娟范小勇曲勍马辉许艳罗玉萍Douglas B.Lowire
- 关键词：分枝杆菌麻风热休克蛋白65多克隆抗体
- 内含子A提高分枝杆菌热休克蛋白65 DNA疫苗的免疫原性
- 2012年
- 目的探讨以内含子A增强外源抗原在真核细胞中的表达效率及其对DNA疫苗在小鼠中免疫原性的影响。方法以分枝杆菌热休克蛋白65（Hsp65）为模式抗原，将其分别克隆入含有内含子A和不含内含子A的真核表达载体pCMV4．0和pVAX1，将表达Hsp65的不同重组质粒瞬时转染人胚肾上皮细胞系293T并免疫接种BALB／c小鼠，应用ELISA分析其所诱导产生的抗原特异性抗体水平及亚类，并以酶联免疫斑点试验（ELISPOT）和胞内细胞因子染色技术（ICS）分析其诱导产生的细胞免疫应答反应。结果含有内含子A的重组表达质粒pCMV4．0hsp65较之不含内含子A的pVAX1hsp65在293T细胞中的抗原表达量更高，免疫小鼠6周后诱导产生的抗-Hsp65特异性总IgG抗体水平（3．76±0．23对3．15±0．22，P〈0．01）和IgG2a／IgG1比值（4．08±0．04对2．234-0．12，P〈0．01）也更高，差异有统计学意义；分泌γ-干扰素（IFN-γ）的CD4^＋T淋巴细胞频率[（2．0±0．058）％对（1．5±0．087）％，t=4．804，P〈0．01]和CD8^＋T淋巴细胞频率[（0．6±0．058）％对（1．0±0．115）％，t=3．098，P〈0．05]增加，差异有统计学意义，提示其诱导产生了增强的Thl型免疫应答。结论内含子A可增强分枝杆菌Hsp65在真核细胞中的表达效率并可提高DNA疫苗在小鼠中的免疫原性。
- 吴娟马辉范小勇曲勍罗玉萍Douglas B．Lowrie
- 关键词：内含子疫苗免疫热休克蛋白质类
