- 线虫抗凝血蛋白c2的融合表达及其抗凝活性分析被引量：1
- 2007年
- 目的:在大肠杆菌中表达硫氧还蛋白-线虫抗凝血蛋白c2(Trx-NAPc2)融合蛋白,并检测其抗凝活性。方法:将扩增的NAPc2基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接到表达载体pET-32a中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),分别经IPTG和乳糖诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用体外凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)试验检测抗凝血活性。结果:构建了pET-32a/NAPc2表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达产物主要以可溶形式存在,纯化的Trx-NAPc2融合蛋白能明显延长PT及aPTT。结论:在大肠杆菌中高效表达了具有生物活性的Trx-NAPc2融合蛋白,为进一步研究NAPc2的功能及应用奠定了基础。
- 彭礼飞邓莉杨陈吴亚敏鲁澄宇胡晶晶
- 关键词：融合蛋白抗凝活性
- 犬钩虫核糖体蛋白L36及S4A全长cDNA克隆与蛋白特性分析被引量：2
- 2007年
- 目的克隆犬钩虫Ancylostoma caninum核糖体蛋白L36(AcaRPL36)及S4A(AcaRPS4A)全长cDNA序列,并对编码的蛋白特性进行分析,探讨它们在研究系统发育中的应用。方法运用3′RACE技术并结合RT-PCR技术先后分别从犬钩虫中克隆核糖体蛋白L36及S4A的部分序列,经拼接后获得全长cDNA序列。用BlastP搜索相似性序列及保守结构域,所获序列在GenBank中登记,并用Neighbor-Joining(NJ)法构建基于RPL36及RPS4氨基酸序列的系统发育树。结果AcaRPL36全长cDNA序列(GenBank登录号为EF490128)为390 bp,开放阅读框为315 bp,编码104个氨基酸组成的蛋白;AcaRPS4A全长cDNA序列(GenBank登录号为EF490129)为880 bp,开放阅读框为786bp,编码261个氨基酸组成的蛋白。RPL36及RPS4序列较保守,与Caenorhabditis elegans等的亲缘关系较近的生物,在系统发育树中的遗传距离也较近。结论首次获得犬钩虫RPL36及RPS4A,RPL36和RPS4可能作为分子指标应用于研究生物系统发育。
- 彭礼飞邓莉吴亚敏胡晶晶杨陈甘伟琼
- 关键词：特性分析
- 十二指肠钩虫抗凝蛋白AduNAP7的原核表达、纯化及抗凝活性鉴定被引量：6
- 2007年
- 目的在大肠杆菌中表达十二指肠钩虫抗凝蛋白AduNAP7并鉴定抗凝活性。方法运用RT-PCR扩增十二指肠钩虫抗凝蛋白AduNAP7成熟蛋白及其组成肽段AduNAP7A、AduNAP7B的编码序列;将编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a及pICET32,构建重组表达质粒;成功构建的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达;用镍亲和层析一步纯化融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白;先后用几丁质亲和层析及镍亲和层析两个步骤纯化自切割后带6×his-tag的目的蛋白;用凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)检测纯化表达产物的体外抗凝活性。结果获得AduNAP7、AduNAP7A及AduNAP7B的编码序列并成功构建了原核表达重组质粒;AduNAP7、AduNAP7A及Adu-NAP7B均在大肠中得到了高效可溶表达,纯化产物具有一定抗凝活性,它们延长aPTT比延长PT更有效。AduNAP7B的抗凝活性显著强于AduNAP7及AduNAP7A。结论AduNAP7具有较强抗凝活性,但显著弱于AcAP5、AcaNAP7及AcAPc2。AduNAP7的抗凝效应可能利于钩虫在人体内的吸血寄生生活,其抗凝作用机制有待进一步研究。
- 彭礼飞邓莉杨陈胡晶晶甘伟琼吴亚敏付汉维
- 关键词：十二指肠钩虫原核表达纯化抗凝活性
- 蛋白质组学在药物研究中的应用进展被引量：1
- 2006年
- 随着基因组学、组合化学和高通量筛选等现代科技的发展,以药物发现为中心的药物研究不断取得新的突破。特别是蛋白质组学这门新科学的发展,大大加速和简化了新药开发的过程。蛋白质组学作为一种全新的技术平台,正日益广泛地应用于药物研究中。本文主要就蛋白质组学的相关概念、技术及其在药物研究中的应用进展作一综述。
- 吴亚敏彭礼飞
- 关键词：蛋白质组学药物研究
- Trx-NAP 5融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性检测被引量：2
- 2007年
- 目的:用大肠杆菌表达获得重组线虫抗凝血肽5(rNAP 5),为研究开发NAP5的功能与应用提供原料来源。方法:将扩增的NAP5基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与表达载体pET-32a连接。构建好的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,分别经IPTG和乳糖诱导表达,并探讨诱导表达条件,分析表达产物的可溶性情况。表达产物经镍亲和纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝活性。结果:成功构建了pET-32a/NAP5表达载体,IPTG和乳糖均能诱导目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地可溶性表达。优化条件下每升LB培养基可获可溶性目的融合蛋白量达65.3mg。纯化的蛋白能明显延长PT及aPTT,7.0mg/L的蛋白平均约延长5.09倍aPTT,2.55倍PT。结论:在大肠杆菌中成功表达了具有很好生物活性的Trx-NAP5融合蛋白,为研究开发NAP5的功能与应用奠定了基础。
- 吴亚敏邓莉彭礼飞杨陈胡晶晶付汉维
- 关键词：融合蛋白大肠杆菌
- 蛲虫核糖体DNA ITS1的PCR扩增及序列分析被引量：4
- 2006年
- 目的扩增人蛲虫(Enterobius vermicularis)核糖体DNA的第一内转录间隔区(ITS1)。方法提取人蛲虫的基因组DNA,PCR扩增rDNA的ITS1及部分5.8S片段,对该片段进行PCR-SSCP分析并测序。结果扩增的片段大小为334bp,包含Enterobius vermicularis全部的ITS-1(303bp)及部分5.8S(31bp)序列,ITS1种内序列一致。结论首次报道人蛲虫的ITS1序列,将为以ITS1作为遗传标记用于蛲虫鉴别诊断、系统发育等研究奠定基础。
- 邓莉吴亚敏彭礼飞王唯唯
- 关键词：蛲虫ITS1
- 十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶基因的克隆与表达被引量：1
- 2009年
- 目的克隆十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶(AdMn-SOD)基因,并在大肠埃希菌中表达。方法用3′RACE及RT-PCR技术扩增获得AdMn-SOD全长cDNA编码序列;设计引物,克隆AdMn-SOD成熟肽编码序列,连接到原核表达载体pET32a,构建重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)并用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况,诱导表达的重组蛋白用Ni亲和层析进行纯化。结果成功克隆获得AdMn-SOD全长cDNA序列,推导编码的氨基酸序列具有Mn-SOD的保守结构特征;构建了pET32a/AdMn-SOD原核表达重组质粒,AdMn-SOD在大肠埃希菌中得到高效表达,表达的融合蛋白的分子质量单位约为40ku。结论成功克隆并表达了十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶基因,为进一步了解十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶的特性与功能奠定了基础。
- 付汉维邓莉何庆丰吴亚敏彭礼飞
- 关键词：十二指肠钩虫
- 犬钩虫C型凝集素AcaCTL-1基因的克隆及表达被引量：1
- 2010年
- 目的分离鉴定犬钩虫C型凝集素AcaCTL-1基因,并在大肠埃希菌中表达。方法根据EST序列设计引物,用RT-PCR及3′(RACE技术扩增获得AcaCTL-1全长cDNA序列,并对其进行初步生物信息学分析;将AcaCTL-1成熟肽编码序列克隆、连接到表达载体pET32a,构建重组质粒pET32a/AcaCTL-1;在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE分析表达情况,Ni亲和层析纯化可溶性蛋白。结果成功克隆了AcaCTL-1全长cDNA序列,其最大开放阅读框由525 bp组成,预测编码174个氨基酸残基组成的蛋白,含17个氨基酸组成的信号肽,为C型凝集素家族蛋白成员;构建pET32a/AcaCTL-1重组质粒,并在大肠埃希菌中高效表达。表达产物多以包涵体形式存在,小部分为可溶性蛋白。结论成功克隆并表达了犬钩虫C型凝集素AcaCTL-1基因,为进一步了解AcaCTL-1的功能奠定了基础。
- 邓莉金娴何庆丰许琴英吴亚敏彭礼飞
- 关键词：C型凝集素克隆
- 十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1)基因的克隆及原核表达被引量：1
- 2007年
- 目的克隆十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1)基因并在大肠杆菌中表达。方法运用3′RACE及RT-PCR技术分别扩增Ad-FAR-1 cDNA部分片段,获得序列经拼接后利用在线BLAST程序检索GenBank中相似的核酸序列及推导的氨基酸序列;设计引物,将Ad-FAR-1成熟肽编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a,构建重组表达质粒并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况。结果成功克隆到Ad-FAR-1全长cDNA序列并构建了pET32a/Ad-FAR-1原核表达重组质粒,Ad-FAR-1融合蛋白在大肠中得到了高效表达。结论成功获得并表达了十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1)基因,为进一步研究该蛋白的特性与功能奠定了基础。
- 彭礼飞胡晶晶邓莉杨陈甘伟琼吴亚敏付汉维
- 关键词：十二指肠钩虫原核表达
- 线虫抗凝血蛋白AcaNAP7基因克隆、表达及抗凝活性鉴定被引量：10
- 2007年
- 目的在大肠杆菌中表达犬钩虫线虫抗凝血蛋白NAP7(AcaNAP7)成熟蛋白,并鉴定表达产物的抗凝活性。方法根据AcaNAP7的核苷酸序列设计引物,从克隆质粒pUCm-T/AcaNAP7中扩增编码AcaNAP7成熟蛋白的基因;扩增产物经双酶切定向克隆到原核表达载体PET-32a中;构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝血活性。结果克隆了编码AcaNAP7成熟蛋白的基因并构建了重组表达质粒pET-32a/AcaNAP7;在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达了融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白,产物主要以可溶形式存在;镍琼脂糖凝胶亲和纯化获得了纯度高达92%的目的蛋白;纯化产物能明显延长PT及aPTT,其延长PT比延长aPTT更有效。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP7融合蛋白,表达产物具有抗凝活性。该实验为进一步研究AcaNAP7的功能及应用奠定了基础。
- 彭礼飞杨陈王会兰吴亚敏邓莉吴铁胡晶晶
- 关键词：克隆抗凝活性
