孟昕
- 作品数：17 被引量：64H指数：4
- 供职机构：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划中国综合性艾滋病研究项目国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 应用ELISPOT方法筛选确定HIV-1 B／C亚型疫苗六种抗原的H-2^d限制的T细胞表位被引量：3
- 2011年
- 为了筛选和确定用于检测表达HIV-1 B'/C亚型病毒6种抗原(gp160、gag、polr、evt、at和nef)的艾滋病疫苗免疫小鼠后H-2d限制的特异性T细胞表位,本研究使用表达上述6种抗原的复制型DNA疫苗和非复制型重组痘苗病毒疫苗联合免疫BALB/c小鼠,通过矩阵设计将HIV-1 B(C)亚型6种相应抗原全序列肽库分别混合成肽池,使用肽池对免疫小鼠进行IFN-γELISPOT检测,根据检测结果确定肽库中特异反应的优势表位肽。结果显示:筛选到七条针对Gag的特异表位肽,其中有5条与文献报道相同,另2条为新表位肽;筛选到3条针对Pol蛋白特异表位肽,其中一条为新表位肽;筛选到2条针对gp160特异表位肽,其中一条为新表位肽;在Nef肽库中筛选到一条新的表位肽;从Tat肽库中筛选到3条表位肽,这三条肽在肽库中是连续的序列,都包含(或部分包含)网上公布的表位序列;在Rev肽库中没有筛选到能够产生阳性反应的特异性表位肽。本研究使用IFN-γELISPOT方法筛选和确定了可用于检测表达HIV-1 B'/C亚型病毒6种抗原(gp160、gag、pol、revt、at和nef)的艾滋病疫苗免疫小鼠后H-2d限制的特异性T细胞表位。
- 齐香荣高瑛瑛陆柔剑邓瑶孟昕谭文杰阮力
- 关键词：HIV-1IFN-ΓELISPOTT细胞表位
- 表达分泌荧光素酶的重组流感病毒构建及体外生物学特性研究
- 2023年
- 目的采用不同的流感病毒骨架构建表达分泌荧光素酶(Gaussia luciferase,Gluc)的重组流感病毒,同时研究其生长特性、遗传稳定性、Gluc表达水平、体外抗流感药物活性。方法在PR8NA的C端插入猪捷申病毒2A肽(porcine teschovirus-2A autocleavage peptide,P2A)自剪切位点及Gluc编码基因,其余7个质粒分别来源于A/Puerto Rico/8/34(PR8)(H1N1)和A/WSN/1933(WSN)(H1N1),通过流感病毒反向遗传学8质粒系统拯救重组病毒,分别命名为PR8NAGluc/PR8和PR8NAGluc/WSN。检测重组病毒遗传稳定性;对比PR8NAGluc/PR8和PR8NAGluc/WSN的荧光强度;检测重组病毒的生长动力学;同时测定PR8NAGluc/WSN荧光强度与半数组织培养感染剂量(median tissue culture infective dose,TCID_(50))的相关性及对奥司他韦、法匹拉韦和莲花清瘟的体外抗流感药物活性。结果通过反向遗传学成功拯救出以PR8和WSN为骨架表达Gluc的重组病毒。相对于PR8骨架,以WSN为骨架明显提高了Gluc的表达且遗传稳定,复制动力学比野生型稍低。PR8NAGluc/WSN荧光强度与TCID_(50)有较好的相关性,其对奥司他韦、法匹拉韦和莲花清瘟具有良好的敏感性。结论以WSN为骨架的重组病毒荧光表达强度比PR8骨架高,为高通量筛选抗流感病毒药物及研发流感病毒载体疫苗提供参考。
- 王东红邓瑶叶飞周剑芳王文黄保英王梦微孟昕谭文杰
- 关键词：反向遗传学荧光素酶重组病毒
- 3个非复制型痘苗病毒基因修饰株细胞生物学特性及小鼠体内毒力比较
- 2023年
- 目的通过对三个非复制型痘苗病毒修饰株的细胞生物学特性及小鼠体内毒力对比研究,为天花/猴痘疫苗替代产品的研制提供参考依据。方法在BHK-21/CEF中对复制型痘苗病毒天坛株(Vaccinia virus Tiantan strain,VTT)和复制缺陷型痘苗天坛株(non-replicating Tiantan Vaccinia virus strain,NTV)及其修饰株NTV-C7L、NTV-△F1L-C7L、NTV-K1L进行扩增纯化及Western blot鉴定后,采用免疫噬斑实验对各病毒株在细胞中的毒力和扩散能力进行评价;通过复制动力学曲线比较各毒株之间的复制差异,采用小鼠滴鼻实验进行体重变化观察,比较病毒的毒力水平。结果Western blot结果证明扩增纯化的痘苗病毒各毒株均正确。免疫噬斑及复制动力学曲线表明三株NTV基因修饰株在CEF中的复制能力与NTV相近;在Vero细胞间的扩散能力和复制能力均有所提高,但复制倍数都小于100倍;在MRC-5中复制水平与NTV相比得到明显增强,其中NTV-C7L的复制倍数达20000倍以上;小鼠体内毒力结果显示三个NTV基因修饰株与NTV相比体重变化无统计学意义。结论三个NTV基因修饰株在人源性细胞MRC-5中恢复了复制能力,但在小鼠中的毒力与NTV相近,具备了作为天花/猴痘疫苗换代产品候选株的初步条件。
- 豆亚美任皎赵莉袁航孟昕田厚文王文玲谭文杰
- 关键词：痘苗病毒毒力
- 非复制型痘苗病毒NTV修饰株NTV-ΔF1L-C7L的构建及免疫效果评价
- 2024年
- 目的对我国非复制型痘苗病毒NTV进行基因改造,以提高其免疫原性。方法通过基于CRISPR-Cas9技术的痘苗病毒同源重组方法,在痘苗病毒F1L基因缺失的同时回插C7L基因,构建NTV修饰株NTV-ΔF1L-C7L。然后将该重组病毒以10^(7) PFU免疫BALB/c小鼠,采用ELISA和ELISpot方法分别检测修饰株NTV-ΔF1L-C7L诱导产生的体液免疫和细胞免疫水平,并采用噬斑减少中和实验测定中和抗体水平。结果经PCR和western blot鉴定证明构建的NTV修饰株NTV-ΔF1L-C7L的F1L基因缺失,同时C7L基因回插在该区域,且C7L基因能正常表达,说明重组病毒构建正确。NTV-ΔF1L-C7L免疫小鼠后,ELISA结果表明重组病毒NTV-ΔF1L-C7L诱导产生的IgG抗体水平高于NTV;ELISpot结果亦能够表明该重组病毒能够诱导产生水平更高的IFN-γ;噬斑减少中和实验结果表明,该重组病毒比NTV能够诱导产生水平更高的中和抗体。结论正确构建了NTV基因修饰株NTV-ΔF1L-C7L,相比于NTV,其能诱导更强的体液免疫和细胞免疫,为我国天花或猴痘疫苗的换代产品研发提供参考数据。
- 任皎袁航赵莉豆亚美刘士元孟昕田厚文王文玲谭文杰
- 关键词：痘苗病毒重组病毒免疫原性
- 三个HIV-1广谱中和表位与HBV S抗原融合表达可诱导小鼠特异性抗体应答被引量：4
- 2008年
- 为了增强HIV-1交叉中和表位的免疫原性,本研究使用PCR克隆技术将HIV-1三个具有一定广谱中和活性的线性抗原表位ELDKWA(简称2F5)、NWFDIT(简称4E10)和GPGRAFY(简称447-52D)基因分别融合到HBV S基因的3'末端,构建了分别表达这三种融合基因的天坛株重组痘苗病毒疫苗RVJ1175S-2F5、RVJ1175S-4E10和RVJ1175S-447-52D,使用这三种重组痘苗病毒感染的细胞培养上清液经分离纯化制备了三种相应的蛋白亚单位疫苗PS-2F5、PS-4E10和PS-447-52D,对重组痘苗病毒和亚单位疫苗中三种融合抗原的生物学及免疫学特性进行了比较研究。PCR和测序结果表明,三种融合基因序列正确重组到痘苗病毒TK区,HBsAg的ELISA检测表明三种融合蛋白有效表达并分泌到细胞培养上清液中,SDS-PAGE凝胶电泳显示三种纯化后的融合蛋白均含分子量为23kD和27kD两种典型HBsAg条带,Western blot证明这两个条带均能与HBsAg抗体反应,并分别能与三种表位相应的HIV-1单抗2F5、4E10和447-52D反应。小鼠免疫结果显示,三种重组痘苗病毒疫苗和三种蛋白亚单位疫苗均能诱发较高水平的HBsAg抗体和相应HIV-1交叉中和表位抗体,蛋白亚单位疫苗诱生的这两类抗体均明显高于对应的重组痘苗病毒疫苗。这些结果为进一步研究三种表位抗体的中和活性和通过不同类型疫苗联合免疫进一步增强其免疫效果研究奠定了基础。
- 李学仁陈红王文邓瑶齐香荣高瑛瑛孟昕谭文杰阮力
- 关键词：HIV-1中和表位重组痘苗病毒
- HIV pol 基因修饰在不同载体系统中对免疫效果的影响
- 2012年
- 目的了解pol基因修饰前后在不同载体系统中表达水平差异对免疫效果的影响，为确定HIV疫苗中能诱发较高水平细胞免疫的Pol靶抗原奠定实验基础。方法将含有优化前后pol基因的HIV-1DNA（pVRC）疫苗和痘苗病毒载体（rVV）疫苗单独或联合免疫BALB／c小鼠，利用IFN-1ELISPOT和ICS检测各组的细胞免疫效果，ELISA检测体液免疫水平，分别比较基因优化前后及在不同载体内的Pol诱发的免疫效果。结果DNA疫苗中pol基因修饰后细胞免疫反应由112提高至258（SFC／10^6 SMNC），抗体滴度随免疫次数增加而提高，基因修饰后第二针的抗体水平由10^1.7提高至10^2.3，三针后则没有差别；而以痘苗病毒为载体的疫苗基因修饰前后细胞免疫反应（～600SFC／10。SMNC）和抗体水平（-10^2.2）均没有差异。两种疫苗联合免疫均可显著提高Pol在小鼠体内的免疫效果，基因修饰后细胞免疫反应由788提高至2500（SFC／10。SMNC），抗体水平则没有差别。结论Pol基因修饰明显提高常规DNA疫苗免疫效果，并可进一步提高联合免疫效果，但对重组痘苗病毒疫苗单独免疫效果无明显影响。
- 高瑛瑛齐香荣孟昕邓瑶谭文杰阮力
- 关键词：痘苗病毒基因免疫法
- 多种HIVB′/C亚型基因在复制型DNA疫苗中表达及免疫效果研究被引量：1
- 2010年
- 为了解多种HIVB′/C亚型基因在复制型DNA疫苗中表达水平及对免疫效果影响,使用复制型DNA疫苗载体pSCK2,分别构建了7种含单种或多种HIVB′/C亚型基因gagpol、gp160和rtn(rev、tat和nef融合基因)的DNA疫苗质粒。免疫荧光检测表明,Gag、Gp160、Rev、Tat和Nef蛋白均能从相应7种DNA疫苗中表达,单基因表达质粒中的基因表达水平和双基因表达质粒中IRES上游的基因表达水平普遍较好。小鼠免疫后,Gag能诱发较高的抗体滴度,Gp160、Pol和RTN的抗体滴度很低;比较研究显示,Gag单独表达和Gag与RTN双表达的质粒均能诱发较好的Gag抗体反应,但Gag与Gp160双表达质粒免疫或含Gag、Gp160和RTN质粒联合免疫的Gag抗体反应均较弱。ELISPOT检测表明,7种DNA疫苗单独或不同组合方式免疫均能诱发针对Gag、Pol、Gp160、Tat和Nef的细胞免疫反应;单基因表达质粒单独免疫诱发的细胞免疫反应最好,含gagpol和gp160双基因表达质粒单独免疫或与含其它基因质粒联合免疫诱发的Gag、Pol和Gp160细胞免疫明显低于含Gagpol或Gp160单基因质粒诱发的相应免疫反应,但诱发的Tat和Nef细胞免疫与相应单基因质粒免疫组无明显差别。本研究结果显示,不同表达构建体的多种HIVB'/C亚型的基因gagpol、gp160和rtn均能从pSCK2质粒中较好地表达;不同基因结构和不同组合免疫的优化,特别是含gag和gp160基因疫苗联合免疫程序的进一步优化对提高其免疫效果是必要的。
- 高瑛瑛邓瑶齐香荣张相民孟昕王慧娟谭文杰阮力
- 关键词：复制子体液免疫细胞免疫
- 表达HIV-1六种基因的非复制型重组痘苗病毒在CEF细胞中遗传稳定被引量：3
- 2011年
- 本研究目的是了解表达HIV-1六种基因的非复制型重组痘苗病毒(rNTV-C)的遗传稳定性(包括病毒载体和六种外源基因:gp160、gag、polr、evt、at和nef)。我们将rNTV-C在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)中连续传代至25代,对第9、12、15以及25代病毒载体基因的稳定性、六种外源基因的稳定性、外源基因表达的稳定性以及外源基因的丢失率进行研究。结果显示:各代病毒均保持了非复制型天坛株痘苗病毒载体特点且传代稳定;HIV-1目的基因序列与原设计序列相符、重组位点正确且遗传稳定,连续传25代核苷酸突变率低于万分之一;目的蛋白在各代rNTV-C中均能有效表达,而且各代病毒之间表达量和分子量无明显差别;以Gag和Nef蛋白表达为标记,rNTV-C各代病毒的基因丢失率均在5%以下。本研究结果为疫苗生产提供了确保毒种稳定的关键资料。
- 齐香荣张相民邓瑶高瑛瑛陆柔剑孟昕谭文杰阮力
- 关键词：HIV-1
- 5个HIV基因修饰可明显提高其在不同系统中的表达被引量：2
- 2012年
- 目的:确定HIV-1疫苗中有效的交叉保护性细胞免疫抗原,提高各个基因在相应疫苗载体中的表达水平,为研究不同抗原在DNA载体和痘苗病毒载体中的免疫原性奠定实验基础。方法:选择HIV B′/C亚型5个以细胞免疫为主的抗原(Gag、Pol、Rev、Tat和Nef),进行基因序列优化及表达结构改造,并分别构建以质粒DNA和重组痘苗病毒为载体的两大类HIV-1疫苗。结果:优化前后5个目的基因均能够在这2种载体中有效表达;虽然采用相同的基因修饰策略,但与痘苗病毒载体相比,在DNA载体中各基因表达水平的提高均较为明显;含有抑制性序列(INS)的gag、pol基因经密码子优化后,Gag、Pol蛋白的表达均明显提高,其中Pol蛋白的提高更为明显,单独pol基因比gagpol天然结构表达水平要高,而gag基因却变化不大;对于rev、tat、nef基因而言,优化后的单独基因结构要略高于优化后的融合结构(hRTN),且二者均高于未优化的融合结构(RTN)。结论:为进一步确定HIV-1疫苗中有效的交叉保护性细胞免疫抗原、研究不同抗原在DNA载体和痘苗病毒载体中的免疫原性奠定了实验基础,为进一步研究DNA疫苗和重组痘苗病毒疫苗联合免疫提供了实验依据。
- 高瑛瑛齐香荣黄保英王文玲邓瑶孟昕谭文杰阮力
- 关键词：HIV-1DNA疫苗痘苗病毒载体密码子优化
- Semliki森林病毒衍生的DNA疫苗与常规DNA疫苗的比较被引量：24
- 2002年
- 比较Semliki森林病毒(SFV)衍生的复制型DNA疫苗载体(复制型载体)和常规非复制型DNA疫苗载体(非复制型载体)的导入效率、表达效率、诱导凋亡率和免疫效果,从而评价其作为DNA疫苗载体的应用前景。使用等量SFV载体和常规DNA载体同等效率转染细胞后,复制型载体表达强度比非复制型载体高约3倍,其诱导凋亡的能力是非复制型载体的11倍;以不同剂量的SFV载体和常规DNA载体分别转染BHK21细胞,复制型载体各剂量组载体的表达量均高于非复制型载体。复制型载体在1μg组出现峰值,而非复制型载体则出现在4μg组。体内免疫的结果表明,SFV载体pSCA-SS1免疫的各组小鼠中,低剂量1μg组小鼠的总抗体滴度高于10μg和100μg剂量组;1μgpSCA-SS1免疫的小鼠产生的总抗体滴度与CTL水平,分别与pcDNA3-SS1免疫的小鼠中10μg和100μg组相当。但10μg、100μg组pSCA-SS1免疫小鼠的总抗体及CTL水平,都低于pcDNA3-SS1免疫的小鼠的10μg、100μg组。结果提示:SFV衍生的复制型DNA疫苗载体,在低剂量组时即可诱生与常规DNA疫苗载体高剂量组相近的免疫效果。
- 邓瑶孟昕许洪林王世峰陆柔剑王文玲谷淑燕阮力
- 关键词：DNA疫苗复制子凋亡
