方之茂
- 作品数：8 被引量：16H指数：2
- 供职机构：四川大学华西基础医学与法医学院更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金国家自然科学基金四川省科委科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 问号赖型钩端螺旋体23kDa蛋白的免疫原性研究
- 2000年
- 目的 探讨 p DL12 1的 1.0 kb0 17株问号赖型钩端螺旋体 DNA片段可否作为钩体重组疫苗广谱保护性抗原的候选。方法 采用 SDS- PAGE制备 2 3k Da蛋白 ,免疫日本大耳兔制备抗 2 3k Da抗血清 ,Western blot鉴定其免疫原性。结果 2 3k Da重组抗原兔抗血清可识别 p DL12 1体外表达 2 3k Da抗原产物和问号赖型钩端螺旋体 0 17株超声抗原成份 ;用 Westemblot鉴定抗血清效价 ,其抗体滴度为 1/ 12 80 0 ;用 p DL12 1重组质粒主动免疫豚鼠 ,可使豚鼠抵抗强毒力株钩端螺旋体攻击 ,表现出免疫保护作用。结论 该重组 2 3k Da抗原有良好的免疫原性 ,可能是赖型钩体 0 17株的保护性抗原。
- 刘洪斌戴保民章涛李胜富方之茂
- 关键词：免疫印迹抗原DNA
- 一种钩端螺旋体DNA疫苗的免疫原性和免疫保护性研究被引量：13
- 1999年
- 为了研究赖型钩体内鞭毛蛋白基因在动物体内的表达及其免疫保护性，采用ＰＣＲ扩增内鞭毛蛋白编码基因，以表达质粒ＶＲ１０１２为载体，构建了含有钩体的内鞭毛基因的重组质粒。在新西兰大白兔四头肌内注射该重组质粒ＤＮＡ５００μｇ／只，重复３次，每次间隔３周，于每次注射前和末次注射后３周，检测血清抗赖型钩体抗体效价。结果显示：在第１次加强免疫注射后３周，试验组血清抗体效价显著增高。豚鼠免疫保护试验表明，该ＤＮＡ重组质粒有明显免疫保护作用，在无佐剂条件下试验组存活率为９０％（９／１０只）。本研究为钩体核酸疫苗研制奠定了基础。
- 游自立戴保民陈庄阎和平方之茂方之茂刘家福
- 关键词：钩端螺旋体DNA疫苗免疫原性免疫保护
- 问号赖型钩体与七日热型钩体内鞭毛蛋白基因的克隆及序列分析
- 2002年
- 目的 筛选钩体核酸疫苗的候选株 ,并从基因水平解释钩体血清型的特异性。方法 通过 PCR方法扩增赖型 0 17株及七日热型 5 6 6 10株钩体的内鞭毛蛋白 (fla B)基因 ;经 T/A快速克隆法将 PCR产物连接于PGEM- T Easy Vector载体。用 α-互补法、PCR法及酶切分析鉴定重组质粒 ,获得了重组质粒 p DHTF0 17和p DHTF6 10 ;双脱氧终止法对两个重组质粒中的克隆化 fla B基因进行测序。结果 两型 fla B基因长 85 2 bp,编码2 83个氨基酸。两个基因的限制性内切酶位点相似 ,含多个常见酶切位点。基因编码的蛋白质预测相对分子质量为31.3× 10 3。结论 几个血清型的 fla B基因同源性达 90 %～ 99%。
- 何泼戴保民乔中东游自立方之茂
- 关键词：赖型钩体钩端螺旋体病
- 问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121及其表达产物的初步研究
- 2000年
- 目的 :探讨问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL12 1外源基因及其表达产物 2 3kDa蛋白的特点。方法 :用 6种内切酶对pDL12 1行酶谱分析 ,用Digoxin标记的pDL12 1外源基因片段作探针对不同种属的钩体进行杂交 ,用SDS -PAGE制备 2 3kDa蛋白 ,Westernblot鉴定其免疫原性。结果 :pDL12 1外源基因没有 6种内切酶的酶切位点 ,重组探针与致病性钩体 (serovarlaistrain 0 17,serovarhebdomadisstrain 5 6 6 10 ,serovarpomonastrain 5 6 6 0 8)有杂交信号 ,与非致病性钩体 (serovarpatocstrainPatocI,serovarillinistrain 30 5 5 )无杂交信号 ,亦不识别大肠杆菌。2 3kDa兔抗血清可识别pDL12 1体外表达的 2 3kDa蛋白带和赖型钩体 0 17株超声抗原成份 ;其抗体滴度为 1/12 80 0 ;用pDL12 1细菌裂解液主动免疫豚鼠 ,可使豚鼠抵抗强毒力株钩体攻击。结论 :pDL12 1外源基因可能是赖型钩体的一个新基因 ;该重组探针能鉴别致病性钩体和非致病性钩体 ;2 3kDa抗原有良好的免疫原性 ,可能是赖型钩体 0
- 刘洪斌戴保民章涛李胜富方之茂
- 关键词：钩端螺旋体属重组质粒
- 问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白与外膜蛋白基因融合DNA疫苗载体的构建被引量：1
- 2002年
- 目的 为增强问号赖型钩端螺旋体 (钩体 0 17株 ) DNA疫苗内鞭毛蛋白基因 (fla B2 )与外膜抗原基因 (omp L1 )的免疫保护作用 ,构建一种能表达 fla B2 与 om p L1 蛋白融合蛋白的 DNA疫苗载体。方法 通过聚合酶链反应分别扩增 0 17钩体 fla B2 与 omp L1 片段并进行融合 ,获得的嵌合基因 om p L1 - fla B2 中含有 10个氨其酸的中间接头序列 ,以维持其空间构象。结果 经酶切鉴定 ,证实有一 1.8kb片段插入载体 ,其 fla B2 及 om p L1 DNA测序结果与文献报道的一致。结论 表达 0 17株钩体 fla B2 与 om p L1 抗原融合蛋白的
- 王敏戴保民游自立方之茂王雅静
- 关键词：外膜蛋白基因融合DNA疫苗
- 赖型钩体pD C 38核酸序列测定及其与流感伤寒型钩体外膜蛋白基因om pL 1核酸序列的类似性匹配被引量：2
- 1999年
- 为了探讨赖型钩体 ｐ Ｄ Ｃ３８ 插入片段基因组 Ｄ Ｎ Ａ 编码、位置与ｏｍ ｐ Ｌ１ 基因的关系，作者采用在流感伤寒型钩体外膜蛋白基因ｏｍ ｐ Ｌ１ 首尾区段设计一对引物，以 ｐ Ｄ Ｃ３８ 插入片段作模板进行 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增、测定和类似性匹配（ａｌｉｇｎｍ ｅｎｔ）。结果发现：ｐ Ｄ Ｃ３８ 含有 ２．７ｋｂ 和３．０ｋｂ 两个插入片段，３．０ｋｂ 片段含有 １ 个ｏｍ ｐ Ｌ１ 基因全拷贝。结论：类似性匹配表明，ｐ Ｄ Ｃ３８ 和ｏｍ ｐ Ｌ１ 相同碱基８６４ 个（９０％ ），碱基变异（不配对）９６（１０％ ）个， ｐ Ｄ Ｃ３８ 可用于钩体诊断、分类、鉴定、疫苗和发病机理的研究。
- 戴保民陈庄DavidA.Haake游自立方之茂
- 关键词：钩端螺旋体病外膜蛋白基因
- 莱姆病螺旋体83kD原浆柱蛋白特异性区段的基因克隆与表达研究
- 2000年
- 目的 为莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制提供靶抗原。方法 根据莱姆病螺旋体 83kD原浆柱蛋白 (p83)特异性区段的基因序列 ,设计一对引物 ,采用PCR技术从莱姆病螺旋体B31株基因组DNA中扩增p83特异性区段的基因片段 ,纯化扩增产物 ,用BamHI和EcoRI双酶切后定向克隆入质粒载体pBK -CMV ;转化大肠杆菌筛选重组克隆。用BamHI和EcoRI双酶切、PCR扩增和DNA序列测定对重组质粒进行鉴定 ,将重组质粒转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SPS -PAGE和Western -blotting分析。结果 1)从莱姆病螺旋体B31株基因组DNA中扩增出p83特异性区段的基因片段 ;2 )将扩增所得的目的基因片段正向插入pBK -CMV的BamHI和EcoRI位点 ,获得重组质粒pBX1。 3)pBX1在大肠杆菌中诱导表达后获得 2 9kD含 β -半乳糖苷酶氨基末端片段的重组抗原。 结论 成功构建了莱姆病螺旋体 83kD原浆柱蛋白特异性区段的基因重组表达载体 ,并在大肠杆菌中获得了稳定的表达 。
- 谢勇恩鲍朗晏菊芳邱洪宇方之茂张会东
- 关键词：莱姆病螺旋体基因克隆
- 问号赖型钩体重组质粒pDJH_2 DNA 序列测定及其与其它细菌omp基因序列比较分析被引量：2
- 1996年
- 对ｐＤＪＨ２片段ＤＮＡ进行了序列测定，结果：插入片段为１８１１个核苷酸；可读框２个：ＯＲＦ１，１－５６５ｂｐ；ＯＲＦ２（从最后一个密码倒算）１－６６２ｂｐ，计算机序列同源性或类似性匹配（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）表明，ＯＲＦ１与ＯＲＦ２的核苷酸类似性为４９．３６％；ＯＲＦ１与Ｌ．ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ（Ｌ．ａｌｓｔｏｎｉ）流感伤寒型ｏｍｐ核苷酸序列类似性为４９．２６％；ＯＲＦ２与Ｌ．ａｌｓｔｏｎｉ类似性为５１．５６％；ＯＲＦ１与其它细菌（包括螺旋体）ｏｍｐ核苷酸序列对准比较，序列类似性均在４３％以上。经查阅ＥＭＢＬＤＮＡ序列数据库未见类似序列。作者认为ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ插入ＤＮＡ片段（ＯＲＦ１与ＯＲＦ２）可能是具有保护作用的ｏｍｐ基因片段。
- 江南戴保民鄢正新杨文天杨文天方之茂李胜富伍卫华方之茂阎蓉华刘家福伍卫华张云刘富先阎蓉华屠云人刘家福黄自英梁莉胡利贞赵慕愚
- 关键词：钩端螺旋体外膜蛋白基因
