余希尧
- 作品数：6 被引量：25H指数：3
- 供职机构：华南农业大学兽医学院更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪流行性腹泻病毒主要结构蛋白在杆状病毒中的表达及免疫原性分析被引量：5
- 2014年
- 为了研制一种有效控制猪流行性腹泻的疫苗,本试验设计了两对引物,分别扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)主要抗原表位S1(S蛋白中一个有效的抗原位点)和M蛋白的基因。将两段基因克隆到杆状病毒双表达载体pFastBacTMDuai中,构建了重组转移质粒pFBD-S1-M,并将其转化至DH10BacTM感受态细胞中制备重组穿梭质粒Bacmid-S1-M,转染Sf9昆虫细胞后,拯救出能够共表达S1和M蛋白的重组杆状病毒rBacmid-S1-M。表达产物经过SDS-PAGE和Western blot检测,共表达的重组S1和M蛋白产物能够与PEDV多克隆抗体发生特异性反应,表明共表达的蛋白具有良好的反应原性。本研究为PEDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。
- 谭博敏蒋志琼余希尧钟泽民黄毓茂
- 关键词：猪流行性腹泻病毒抗原表位杆状病毒表达
- 里氏木霉分泌型表达载体的构建及绿色荧光蛋白的表达被引量：2
- 2014年
- 【目的】构建里氏木霉分泌型表达载体,通过表达绿色荧光蛋白论证载体的可行性并初步观察绿色荧光蛋白在里氏木霉中的分泌过程。【方法】应用PCR及分子克隆技术将里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶(CBH1)的启动子及CBH1自身信号肽、终止子和潮霉素筛选基因依次插入骨架质粒pUC19中,构建出T.reesei表达载体Ppth15。将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因装载入Ppth15中,获得eGFP表达载体Ppth15-eGFP。再将Ppth15-eGFP转化进T.reesei原生质体,通过潮霉素抗性筛选、基因组PCR检测等方法鉴定,获得阳性重组转化子。【结果】用PDA培养基培养阳性转化子2-3 d后,可在菌丝顶端、隔膜及培养基中清晰地观察到大量绿色荧光。【结论】表达载体构建成功且能够用于eGFP的表达,实验为进一步研究T.reesei表达其他基因提供了有效工具,同时为T.reesei胞外蛋白分泌的研究提供了参考。
- 余希尧钟泽民黄毓茂谭博敏蒋志琼
- 关键词：里氏木霉增强型绿色荧光蛋白
- 猪流行性腹泻病毒S1基因在毕赤酵母中的表达被引量：7
- 2014年
- 为了研制一种能够高效表达猪流行性腹泻病毒S1主要抗原表位基因的新型疫苗,将S1主要抗原表位基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建了重组质粒pPICZαC-S1,对重组质粒经SacⅠ酶切线性化后通过电转化法转化到毕赤酵母X-33中,经ZeocinTM抗性筛选后得到阳性转化子(pPICZαC-S1),转化子接种培养基后用甲醇进行诱导,并对诱导结果进行SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定。结果表明,纤突蛋白主要抗原表位在毕赤酵母中成功分泌表达,表达的蛋白分子质量为42ku,且能够与PEDV阳性血清特异性结合。
- 谭博敏余希尧钟泽民蒋志琼黄毓茂
- 关键词：猪流行性腹泻病毒抗原表位分泌表达毕赤酵母
- 猪表皮生长因子在植物乳杆菌中的表达及其活性检测被引量：9
- 2015年
- 为获得一株高效表达猪表皮生长因子(p EGF)的重组植物乳杆菌,并检测其生物活性,从仔猪肠道内容物中分离植物乳杆菌,选择其中生物活性最强的一株(Lp-1)为宿主。以商品化乳杆菌表达载体p IAβ8为骨架,干酪乳杆菌超强组成型启动子SCP、M6前体蛋白信号肽SP、猪表皮生长因子p EGF等为元件,构建表达p EGF的植物乳杆菌重组表达载体p SCPSE。用电转化方法 (2.0 k V,2 000?,25μF,4.0 ms)将重组载体p SCPSE转化入宿主菌Lp-1中获得重组植物乳杆菌Lp-p SCPSE。以Tricine-SDS-PAGE法和p EGF ELISA特异性检测试剂盒检测目的蛋白的表达;用培养12 h的阳性转化子菌体给刚断奶的BALB/c小鼠灌胃,2次/d,连续10 d,以断奶小鼠的体重、肠绒毛长度和隐窝深度的变化为指标,检测目的蛋白的生物活性。Tricine-SDS-PAGE检测和小鼠实验结果显示,重组植物乳杆菌的培养上清中出现6 k Da左右p EGF的特异性条带,且表达p EGF的重组植物乳杆菌能显著增加(P<0.05)断奶小鼠的体重、肠绒毛高度和肠隐窝深度。结果表明,p EGF在植物乳杆菌中成功表达,且具有良好的生物学活性。
- 钟泽民赖强余希尧刘德辉黄毓茂
- 关键词：猪源乳酸杆菌绒毛高度隐窝深度
- 黑曲霉分泌表达载体的构建以及绿色荧光蛋白的表达被引量：1
- 2013年
- 采用PCR扩增得到糖化酶基因启动子(PglaA-g)、色氨酸合成酶基因终止子(TtrpC)和潮霉素抗性筛选标记基因,依次连接这些基因元件,获得黑曲霉Aspergillus niger分泌表达载体pPHT.EGFP基因与黑曲霉表达载体pPHT连接,得到重组表达载体pPHT-EGFP.pPHT-EGFP表达载体通过原生质体转化法转化黑曲霉,经潮霉素抗性筛选、基因组PCR鉴定阳性重组转化子.荧光显微镜观察表明,绿色荧光蛋白成功表达,而且荧光的分布具有一定的规律,主要集中在菌丝顶端、膈膜以及培养基中;固体培养基发出绿色荧光,表明绿色荧光蛋白分泌到培养基中,属于分泌性表达,蛋白分泌的部位主要位于菌丝顶端.
- 郑红玉黄毓茂余希尧钟泽民项林盛唐丽云
- 关键词：EGFP基因黑曲霉
- 丹毒丝菌SpaA基因免疫保护区的克隆及其在毕赤酵母中的表达被引量：3
- 2015年
- 【目的】以毕赤酵母Pichia pastoris X-33为宿主表达猪丹毒丝菌Erysipelothrix rhusiopathiae Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.【方法】以采集于广东某猪场的猪丹毒丝菌为模板,根据NCBI中已发表的Spa基因c DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增得到Spa A-N,并将其连接到表达载体p PICZαC上,得到重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N;用Sac I酶将重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N线性化后电转化入毕赤酵母X-33,经含博来霉素ZencinTM抗性的YPDS平板筛选和PCR鉴定的阳性转化子,用含不同浓度博来霉素抗性的YPDS平板筛选出高拷贝子并进行甲醇诱导培养,分别于诱导48、72、96 h后离心收集上清液,立即做SDS-PAGE,并进行SDS-PAGE及Western-blot试验.【结果和结论】成功克隆并表达了Spa A-N基因,构建了重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N,并以毕赤酵母X-33为宿主成功表达了猪丹毒丝菌Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.丹毒丝菌Spa A-N作为免疫保护区在酵母宿主中得以成功表达.
- 蒋志琼钟泽民谭博敏余希尧黄毓茂
- 关键词：毕赤酵母亚单位疫苗
