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孙元杰: 作品数：17 被引量：24H指数：3; 供职机构：第四军医大学更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划军队医药卫生科研基金更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

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PRR13/GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定: 目的:克隆人PRR13全长编码区基因,构建原核表达载体,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化以及特异性鉴定。方法:采用PCR技术从人c DNA文库中扩增出富含脯氨酸的人PRR13全长编码区基因,设计适当的酶切位点,将...; 孙元杰宋朝君张葵汤蕾魏玉英李娜金伯泉杨琨; 关键词：原核表达 SDS-PAGE WESTERN BLOT

B细胞受体相关蛋白31对胶质瘤细胞行为的影响: 研究背景：胶质瘤作为人类神经系统恶性程度极高的肿瘤,具有生长速度快,恶性程度高,易复发等特点,病因尚不明确.B细胞受体相关蛋白31 (BCAP31)为内质网跨膜蛋白,其功能可作为载体蛋白促进多种小分子的胞内运输从而参与细...; 李子超姜东伯杨舒雅王静孙元杰赵国庆杨琨; 关键词：肿瘤睾丸抗原基因表达调控免疫组化

国际汉坦病毒研究进展——第9届肾综合征出血热、汉坦病毒肺综合征及汉坦病毒国际会议概况被引量：4: 2013年; 汉坦病毒所导致的肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是威胁我国公众健康的严重问题。据我国疾控中心的监测数据显示，2006—2011年间共有64250例确诊感染HFRS病例，其中死亡762人，死亡率达1．18％，发病率和死亡率在2010年后持续上升。疫情最严重的8个省分别是黑龙江、陕西、山东、吉林、辽宁、浙江、湖南和河北，其患病人数覆盖总数的80．2％。患病多发生于春季和秋冬交替时，年龄多集中在15～60岁之间，男性患者数量是女性患者的3倍以上，农民罹患风险最严重。黑线姬鼠和褐家鼠分别是我国汉坦病毒主要的野生宿主和社区宿主。; 姜东伯孙元杰董忱杜军英杨琨; 关键词：汉坦病毒肺综合征肾综合征出血热 FEVER 死亡率公众健康

抗SEB单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的基因构建和表达被引量：1: 2013年; 目的从分泌抗SEB的单克隆抗体(FMU-SEB-No.1)杂交瘤细胞中,克隆出FMU-SEB-No.1重链和轻链可变区(VH和VL)基因,构建FMU-SEB-No.1单链抗体(scFv)的原核表达载体,并进行scFv基因的蛋白表达。方法从FMU-SEB-No.1杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR扩增出VH和VL基因;通过在引物上设计linker序列,拼接VH和VL为完整FMU-SEB-No.1的scFv基因(FMU-SEB-scFv)。将测序正确的scFv基因克隆入PGEX4T-1载体,转化入E.coli BL21(DE3)进行蛋白表达。通过SDS-PAGE,Western blot法分析其表达水平和特异性,酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其抗原结合活性。结果测序结果显示,本实验成功克隆出FMU-SEB-No.1重链及轻链可变区基因,并成功构建FMU-SEB-scFv基因,所得的基因全长为750 bp,编码250个氨基酸。SDS-PAGE和Western blot分析表明,PGEX4T1-FMU-SEB-scFv在E.coli BL21(DE3)可表达为Mr约54 000的可溶型scFv/GST融合蛋白。间接ELISA检测结果表明,可溶型scFv/GST融合蛋白与SEB具有较高的抗原结合活性。结论制备并鉴定了针对SEB的基因工程抗体,为开发出针对SEB的治疗性抗体奠定了实验基础。; 孙元杰李永明刘志佳张葵魏玉英宋朝君周幸春金伯泉杨琨; 关键词：SEB 单链抗体蛋白表达酶联免疫吸附法

抗肿瘤基因疫苗载体的构建及抑瘤活性研究: 目的：构建可表达具有强免疫源性，且可同时诱导体液免疫和细胞免疫的复合肿瘤抗原的基因疫苗载体，使其具有较强的抑瘤活性.意义：基因疫苗可以诱导、调控免疫应答且简单多样，给多种疾病，尤其是恶性肿瘤的治疗带来希望.肿瘤特异性抗体...; 魏玉英孙元杰李海涛龚玖瑜张贇金伯泉杨安钢宋朝君杨琨; 关键词：基因疫苗恶性肿瘤 LAMP

抗B型葡萄球菌肠毒素高亲和力单链抗体的制备被引量：1: 2013年; 目的构建针对B型葡萄球菌肠毒素(SEB)的特异性单链抗体(scFv),并进行纯化和鉴定。方法设计抗SEB高亲和力单克隆抗体(mAb)FMU-SEB-No.2重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗SEBmAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段;然后通过在轻链引物上设计linker序列,重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成scFv基因片段,并将其克隆入原核表达载体PGEX4T-1中;转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,融合蛋白经谷胱甘肽亲和层吸柱纯化。采用SDS-PAGE,Western blot,ELISA等方法对其表达水平和特异性进行分析。结果成功从1株抗SEB mAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL可变区基因,并通过linker序列将其拼接成scFv片段,大小约750 bp,编码250个氨基酸。PCR、酶切鉴定和测序结果表明表达载体构建成功。转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,以可溶形式表达相对分子质量(Mr)约54 000的融合蛋白。经谷胱甘肽亲和层析法纯化融合蛋白,可获得纯度达90%以上的scFv,ELISA和Western blot法检测结果表明,可溶性scFv与抗原SEB有较强的结合活性。结论成功构建并表达出抗SEB的特异性单链抗体。; 孙元杰李永明张葵魏玉英宋朝君周幸春金伯泉杨琨; 关键词：单链抗体 WESTERN BLOT

一种检测A型肉毒毒素的高灵敏度酶联免疫吸附法被引量：3: 2012年; 目的:建立检测A型肉毒毒素的酶联免疫吸附法。方法:利用重组A型肉毒毒素重链羧基端片段作为免疫原和B淋巴细胞杂交瘤技术,获得了56株高亲和力的抗A型肉毒毒素单克隆抗体(mAb),建立了检测A型肉毒毒素的双mAb夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。结果:该方法理论检测下限达到了8.34 pg/mL,检测天然A型肉毒毒素制剂时其实际检测下限可达0.78 LD50/mL,与其他型别的肉毒毒素均未见交叉反应。通过测定基质中的回收率,发现基质中的相关的蛋白对检测具有较大的影响。结论:该方法具有灵敏度高,特异性好,使用方便等优点,具有较高的的实用价值。; 刘志佳李永明宋朝君李娜卢卫嘉孙元杰毛晓燕杨琨金伯泉; 关键词：A型肉毒毒素酶联免疫吸附法单克隆抗体

自身免疫性脑炎患者外周血Tfh细胞的检测及其临床意义被引量：8: 2017年; 目的:研究滤泡辅助性T细胞(Tfh)在自身免疫性脑炎(AE)患者外周血中的百分比及临床意义。方法:(1)采用自身免疫性脑炎相关抗体检测阳性的患者脑脊液与大鼠脑组织冰冻切片共孵育并进行免疫荧光染色,观察结果;(2)收集血清和/或脑脊液(CSF)检查自身免疫性脑炎相关抗体阳性的患者17例(其中,3例为抗LGI1抗体阳性患者,3例为抗GABAR抗体阳性患者,10例为抗NMDAR抗体阳性患者,1例为抗NMDAR抗体、抗GABAR抗体及抗AMPA2抗体合并阳性患者),收集外周血样本共计21例次:未治疗组6例次,治疗组15例次(其中,治疗后缓解组8例次,治疗后未缓解组7例次),健康对照者(对照组)外周血15例。采用流式细胞术(FCM)检测外周血单个核细胞(PBMC)中CD3+CD4+CXCR5+PD1+(即Tfh细胞)的比例,并分析Tfh细胞比例与患者疾病恢复程度的相关性。结果:(1)自身免疫性脑炎相关抗体检测阳性患者脑脊液与大鼠脑组织冰冻切片共孵育免疫荧光染色结果呈现明显阳性反应;(2)流式细胞术检测结果显示未治疗组患者外周血Tfh比例明显高于对照组(P<0.001),且治疗未缓解组患者Tfh比例高于治疗缓解组(P<0.05),而治疗缓解组患者Tfh比例与对照组比较,差异无统计学意义(P=0.107)。结论:自身免疫性脑炎患者外周血Tfh比例升高可能与疾病的发生发展相关。; 刘婷婷杜芳孙元杰杨毅宁代文赵钢杨琨; 关键词：滤泡辅助性T细胞自身抗体

截短型BAP31/GST基因重组质粒的构建及融合蛋白的表达、纯化和鉴定: 2011年; 目的构建编码截短型肿瘤抗原BAP31(△BAP31)与GST融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并对融合蛋白(△BAP31/GST)进行纯化和初步鉴定。方法 PCR扩增编码△BAP31的基因片段,上下游分别引入EcoR I及Xho I酶切位点,亚克隆至含有GST标签的原核表达载体pGEX4T-1中,构建重组表达载体pGEX4T1-△BAP31,将该载体转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达△BAP31/GST,用GST亲和层析分离纯化原核表达的△BAP31/GST,表达产物分别用SDS-PAGE和West-ern blot进行鉴定。结果重组质粒经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切鉴定和IPTG诱导表达△BAP31/GST的SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量为40 000,与理论值相符,并主要以可溶性蛋白形式存在;经过对融合蛋白表达条件的优化,在IPTG浓度为1 mmol/L,诱导6 h目的蛋白表达量最高;灰度扫描分析发现,融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的70.6%,纯化产物的纯度最高可达94.5%,Western blot证实该△BAP31/GST可与抗GST单克隆抗体(mAb)发生特异性结合反应,分子量为△BAP31与GST分子量之和,提示为融合蛋白。结论成功构建了编码△BAP31基因原核表达载体pGEX4T1-△BAP31,利用大肠杆菌表达系统和GST亲和层析,获得了较高纯度的△BAP31/GST融合蛋白,为进一步研究肿瘤抗原BAP31的功能及开发以BAP31作为靶点的肿瘤疫苗提供了试验基础。; 李海涛宋朝君孙元杰魏玉英李永明刘飞刘志佳张葵金伯泉杨琨; 关键词：GST 融合蛋白蛋白表达

以肿瘤抗原BAP31为靶点的基因疫苗构建及其诱导小鼠免疫反应的研究被引量：3: 2009年; 目的:构建重组表达载体P-BAP31和P-L-BAP31基因疫苗并接种小鼠,评价其诱导的体液和细胞免疫应答。方法:利用分子克隆技术,构建重组质粒P-BAP31和P-L-BAP31,同时构建P-BAP31/EGFP和P-L-BAP31/EGFP重组质粒,并将其以脂质体瞬时转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察目的蛋白的表达;将重组质粒P-BAP31和P-L-BAP31免疫C57BL/6小鼠,采用间接ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价;通过酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测免疫脾细胞在受到BAP31抗原刺激后产生IFN-γ和IL-4细胞因子的频率;通过乳酸脱氢酶(LDH释放)试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答。结果:酶切及测序结果表明,成功构建了针对BAP31肿瘤抗原的P-BAP31和P-L-BAP31基因疫苗。通过荧光显微镜观察重组质粒转染的HeLa细胞,可见EGFP报告基因表达的绿色荧光。ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价发现,带LAMP组明显高于不带LAMP组(P<0.05),且两者均高于空质粒(P-LAMP)及正常对照(N)组(P<0.01)。ELISPOT检测脾细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的频率,带LAMP组与其他组相比显著提高(P<0.01)。LDH释放试验显示,带LAMP组的特异性CTL活性高于不带LAMP组,且均高于对照组(P<0.01)。结论:构建了针对肿瘤抗原BAP31的全长基因疫苗,以其免疫C57BL/6小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫反应,其中,P-L-BAP31基因疫苗各项免疫反应均优于P-BAP31。; 宋朝君孙元杰魏玉英张赟欧阳清陈琨金伯泉杨琨; 关键词：基因疫苗 ELISPOT

孙元杰

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