李东
- 作品数：25 被引量：34H指数：4
- 供职机构：扬州大学动物科学与技术学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金江苏高校优势学科建设工程资助项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学环境科学与工程医药卫生更多>>
- 卵泡刺激素诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究被引量：4
- 2014年
- 文章探讨了卵泡刺激素(FSH)诱导鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化的作用效果。首先对FSH的适宜诱导浓度进行筛选,再将传至2代的ESCs,在RA和支持细胞诱导的基础上添加适宜浓度的FSH进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测。筛选出适宜的FSH浓度为25 ng/mL。单独使用FSH诱导,未出现类SSCs样细胞;FSH与支持细胞诱导至第6天出现类胚体,至第12天,出现少量精原样细胞;FSH联合支持细胞和维甲酸(RA)进行诱导,至第2天出现类胚体,第12天出现类SSC样细胞。实时荧光定量PCR结果显示,FSH+支持细胞组、FSH+支持细胞+RA组中,Stra8、integrinβ1、Dazl表达量都持续上调,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下调趋势。添加FSH的诱导组中Stra8的表达量相对于各对照组上调显著。FSH单独诱导不能引起ESCs向雄性生殖细胞分化,但具有促进支持细胞和RA诱导ESCs向雄性生殖细胞分化的作用效果,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础。
- 蒋一秀许厚强左其生张蕾李东施青青张亚妮李碧春
- 关键词：鸡胚胎干细胞雄性生殖细胞分化卵泡刺激素
- 鸡胚胎干细胞向精原干细胞分化过程中关键lncRNA的筛选
- 本文旨在探索鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)向精原干细胞(Spermatogonia stem cell,SSC)分化过程中关键lncRNA 及靶基因,并探究其作用机制,为ESC 体外向SS...
- 李东纪艳芹王颖洁王飞路镇宇何娜娜靳锴汪怡临程少泽王曼张文慧张晨赵瑞丰张亚妮李碧春
- 关键词：胚胎干细胞原始生殖细胞精原干细胞靶基因
- 山羊iPS细胞诱导及培养体系的优化
- 2014年
- 为了高效、持续的诱导获得并培养山羊诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS),本研究从饲养层和培养液方面进行优化。将分离获得3代以内的小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)、山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblast,GEF)用丝裂霉素C处理后,分别按1×105 mL-1 MEF、1×105mL-1 GEF、5×104 mL-1 MEF+5×104 mL-1 GEF的密度接种,以高糖DMEM+20%胎牛血清(FBS)和KnockoutDMEM+20%血清替代物(KSR)为培养液,研究不同饲养层种类和培养液对山羊iPS细胞获得和培养的影响。结果显示,山羊iPS细胞在接种密度为5×104 mL-1 MEF+5×104 mL-1 GEF的饲养层上,使用KnockoutDMEM+20%KSR组合的培养液,山羊iPS细胞的诱导效率以及消化传代后的克隆形成率均极显著高于其他5组(P<0.01)。对该组培养的山羊iPS细胞进行碱性磷酸酶(AKP)染色呈阳性;Oct4、SSEA-1、Tra-1-60、Tra-1-81免疫荧光检测呈阳性;RT-PCR检测有Oct4、Sox2、Klf4和Nanog基因的表达;体外能分化形成类胚体。结果表明,将细胞接种在密度为5×104 mL-1 MEF+5×104 mL-1 GEF的饲养层上,使用KnockoutDMEM+20%KSR的培养液更适合山羊iPS细胞的获得和培养。本试验为山羊iPS细胞的体外研究、临床试验、动物基因组修饰和山羊胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES)的建系奠定基础。
- 邱峰龙左其生李东李伟陈庭锋韦光辉李碧春
- 关键词：饲养层培养液IPS细胞山羊
- 猪精原干细胞体外分离培养及诱导分化的研究被引量：4
- 2014年
- 本研究旨在建立猪精原干细胞(Porcine spermatogonial stem cells,pSSCs)体外分离和诱导分化,并探索pSSCs定向分化及分化过程中关键基因的表达情况。采用差速贴壁法分离pSSCs和支持细胞(Sertoli),采用生化和免疫学方法鉴定其干细胞特性;传至3代后通过添加不同诱导剂,诱导SSCs向脂肪细胞、神经元样细胞和成骨细胞分化,并通过生化染色、qRT-PCR和免疫细胞化学检测诱导效果。结果表明:分离得到的pSSCs在饲养层上生长良好,碱性磷酸酶(AKP)及SOX2、integrinα6、SSEA1、Dazl抗体鉴定均呈阳性,表明SSCs处在未分化状态。诱导8d后,甲苯胺蓝染色及NSE抗体鉴定成阳性,成功诱导SSCs为神经元样细胞;诱导16d后,ALP、Von Kossa染色及Collagon l抗体鉴定均呈阳性,诱导SSCs为成骨细胞;诱导22d后,油红O染色可见脂滴被染成红色,诱导SSCs成为脂肪细胞。在SSCs诱导过程中,qRT-PCR结果显示,Nestin和β-tubulin在6d左右表达量最高,Cbfα1和Osterix在12d左右表达量最高,PPARγ和C/EBPα在18d左右表达量最高。本研究成功分离获得pSSCs,并且pSSCs可分别定向诱导分化为成骨细胞、神经元样细胞和脂肪细胞,表达细胞特有标记基因。
- 陈庭锋王霄燕李东施青青张蕾邱峰龙刘志永庄勋卞桂华宋成义李碧春
- 关键词：精原干细胞体外培养诱导分化基因表达
- 蛋白质代谢通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控被引量：1
- 2016年
- 【目的】探究蛋白质代谢在鸡雄性生殖细胞分化过程中的作用机制,为完善鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)体外向雄性生殖细胞诱导分化体系研究提供依据。【方法】采用流式分选的方法获取高纯度的ESC、原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)和精原干细胞(spermatogonia stem cell,SSCs),分别提取细胞的总RNA,采用RNA-Seq方法对3种细胞的转录本进行深度测序,然后进行WEGO(web gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析,筛选出鸡雄性生殖细胞分化过程中参与蛋白质代谢的关键通路及其关键基因,RT-q PCR(Real time Quantitative PCR)检测部分关键差异基因的表达变化,并与RNA-Seq(RNA sequencing)结果进行比较分析,同时分别从体内和体外水平对关键基因NOS2进行抑制,观察各分组不同天数的细胞形态变化及检测NOS2和C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因表达变化情况。【结果】在雄性生殖细胞分化的整个阶段,有697个差异基因参与生物代谢,显著富集于精氨酸-脯氨酸代谢通路、酪氨酸代谢通路以及色氨酸代谢通路,在这3条通路上筛选出NOS2、FAH和IDO等关键性基因,这些基因的在ESCs向SSCs分化过程中表达变化趋势与其在RNA-Seq中的结果一致。体内抑制NOS2基因后,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因在空白组和对照组之间无显著性的差异,而在抑制剂组中,NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖标记基因的m RNA表达量均出现了降低;而体外抑制NOS2基因后,对照组中的ESCs在2、4、6、8和10d内细胞不断增殖,但是未出现类胚体;RA诱导组中,2d出现小的类胚体,4d类胚体增大,且数量增多,6d类胚体边缘开始出现破裂,8d类胚体解体,10d出现类精原样细胞;抑制剂组中,ESCs在2、4、6、8和10d内无类胚体出现,且相较于对照组细胞增殖缓
- 李东汤贝贝王颖洁纪艳芹王飞路镇宇王曼张亚妮李碧春
- 关键词：鸡胚胎干细胞原始生殖细胞精原干细胞雄性生殖细胞
- 鸡蛋开窗法对嵌合体鸡制备效率的影响
- 2015年
- 将受体种蛋分为3组,分别经换壳法、钝端开窗法和赤道面开窗后,比较3种开窗方法对孵化率的影响;分离培养鸡胚胎干细胞(ESCs),体外培养传代后用线性化的质粒p EGFP-N1转染鸡ESCs,比较显微注射时3种不同的处理方法对孵化率的影响;对获得的嵌合体鸡分别提取血液和组织DNA后进行PCR检测。结果表明:赤道面开窗法的孵化率显著高于换壳法和钝端开窗法(P<0.01);开窗后,显微注射经转染的ESCs组孵化率显著低于其他2组(P<0.01);PCR检测结果显示,有四只嵌合体鸡的部分器官表达了EGFP基因,其中两只鸡的性腺发生EGFP基因的嵌合。表明赤道面开窗后,对受体鸡胚下腔显微注射经转染的ESCs可以生产嵌合体鸡,产生嵌合体鸡的效率为4.17%。
- 王颖洁张文慧左其生李东张蕾汤贝贝连超肖天荣张亚妮李碧春
- 关键词：开窗法显微注射
- 如皋黄鸡功能未知基因C1EIP表达载体的构建及其抗小鼠血清制备被引量：1
- 2017年
- 为了深入研究鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向雄性生殖细胞分化过程,基于RNA-Seq基础,筛选出功能未知且差异极其显著的关键基因C1EIP,PCR克隆得到其编码区全长序列409bp,构建其真核表达载体pcDNA3.0-C1EIP和pEGFP-C1EIP,实现C1EIP在真核细胞内的定位表达,并以PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP后免疫小鼠制备抗血清。间接免疫荧光检测抗血清效价为1∶10,RT-PCR和Western blot证实C1EIP真核表达载体成功表达且抗血清效果良好,为C1EIP基因在ESCs向雄性生殖细胞分化过程中的功能研究奠定了基础。
- 李东王飞纪艳芹汪怡临王曼张晨王颖洁何娜娜靳锴路镇宇程少泽张亚妮李碧春
- 关键词：如皋黄鸡真核表达抗血清
- TGFβ信号通路对鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的作用研究
- 前言生殖细胞在有性繁殖的生物中肩负着将遗传信息在世代中传递的任务，并能代替胚胎干细胞(ESCs)用于治疗和遗传修饰，而不涉及伦理和免疫排斥问题。但是，如何在体外培养条件下获得大量的精原干细胞(SSCs)并使其能够产生具有...
- 张亚妮施青青王颖洁左其生李东连超毕瑜林王飞纪艳芹路镇宇李碧春
- 关键词：鸡胚胎干细胞雄性生殖细胞分化
- 口吸管法制备DF-1单细胞克隆
- 取对数期末的DF-1细胞,通过手工拉针连接橡皮管制备的单细胞分离装置,于倒置显微镜下收集DF-1单细胞.收集的单细胞培养于同源条件培养基中,形成单细胞克隆之后传代并建立DF-1单克隆细胞系;采用连续细胞计数绘制DF-1单...
- 赵瑞丰靳锴金晶王颖洁李东左其生张亚妮李碧春
- 关键词：条件培养基染色体核型分析
- 多能性转录因子mRNA转染山羊胎儿成纤维细胞条件优化
- 2015年
- 【目的】为了优化外源多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA转入山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblast,GEF)的条件,本试验针对转染试剂脂质体2000和转染方法进行研究。【方法】采用胰酶消化法,从山羊胎儿腿部肌肉组织中分离并获得了纯化的GEF细胞。根据m MESSAGE m MACHINE®T7 Ultra Kit试剂盒说明书,体外转录步骤主要有:1前期的质粒准备:首先用质粒小提试剂盒对摇菌获得的各体外转录载体质粒进行提取,随后对各体外转录载体目的基因下游进行单酶切,获得线性化质粒,最后用DNA纯化试剂盒对线性化的质粒进行纯化;2mRNA的"加帽":以线性化DNA为模板,合成带有5′端帽子结构的mRNA,添加TURBO DNase以除去模板DNA;3mRNA的"加尾":以ATP为原料,利用试剂盒自带的Poly(A)聚合酶,对已经"加帽"的mRNA进行"加尾",以合成结构完整的mRNA;4完整mRNA的纯化:按照MEGAclearTM Kit试剂盒对mRNA进行纯化。随后,将体外转录获得各转录因子的mRNA进行浓度和OD值测定。分别比较总mRNA(EGFP和4种多能性转录因子的mRNA的质量分别为0.2μg)和脂质体2000的比例为1?0.5、1?1.0、1?1.5、1?2.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2、4、6代GEF细胞的mRNA转染效率。对最佳转染体系下转染多能性转录因子mRNA的GEF细胞进行免疫荧光检测,并对转染多能性转录因子mRNA后GEF细胞的形态和数目进行观察。【结果】mRNA和脂质体2000的比例为1?1.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2代GEF细胞的mRNA转染效率均显著高于其他组(P<0.05),且本组细胞在形态和生长方面相对较好;免疫荧光检测表明,4种多能性转录因子的mRNA在GEF细胞中定位于细胞核,并获得稳定表达,在细胞质中不见多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的表达;GEF细胞在转染4种mRNA 24h后,细胞形态由梭状慢慢向圆形靠拢;细胞活力低于对照组(山羊成纤维细�
- 肖天荣张蕾邱峰龙李伟左其生李东李碧春
- 关键词：MRNA转染转录因子
