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杨海元: 作品数：20 被引量：17H指数：2; 供职机构：南京医科大学更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>; 相关领域：医药卫生生物学文化科学更多>>

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用于异种移植的新型基因改造猪的培育被引量：1: 2014年; 目的培育用于异种移植的新型基因改造猪,在α-Gal基因敲除以及膜辅蛋白CD46、血栓调节蛋白(TM)基因转入的基础上,进一步将Ⅱ类反式激活因子基因N端缺失显性负向(CⅡTA-DN)基因转入猪胎儿成纤维细胞,以抑制猪白细胞抗原(SLA)Ⅱ类分子的表达。方法设计合成博来霉素(Zeocin)抗性基因片段,并将其与含有CⅡTA-DN基因的pST205载体连接,构建置于人Tie2增强子和CMVβ-actin启动子下游的pNMU105/CⅡTA-DN表达载体,将线性化的pNMU105通过脂质体转染法转入已经敲除了α-Gal并转入CD46、TM基因的猪胎儿成纤维细胞181B(DKO/CD46/TM)。Zeocin抗性筛选转染pNMU105质粒的181B细胞,PCR方法检测CⅡTA-DN基因在181B细胞中的转入,获得阳性单克隆并进行核移植,得到DKO/CD46/TM/CⅡTA-DN转基因猪。取仔猪的耳缘组织裂解后进行基因鉴定。结果成功设计Zeocin抗性基因片段并构建pNMU105/CⅡTA-DN表达载体,经过质粒转染和Zeocin抗性药物筛选获得多株阳性单克隆,顺利通过核移植得到转基因猪。仔猪耳缘组织经PCR鉴定,在592 bp位置检测到预期条带,证明均为CⅡTA-DN转基因阳性。结论通过新型基因改造猪的培育,在抑制超急性排斥反应和补体反应、降低凝血和人CD4+T细胞免疫反应的理论基础上进行了转基因模型猪的构建,为异种移植中更加有效地减少免疫损伤、提高移植器官的存活做出了新的尝试。; 李倩坤王盈张曼玲杨海元程俊霖赵丽华任子健陈凤娇万振昆张纬李荣凤戴一凡; 关键词：异种移植

GGTA1/CMAH/β4GalNT2三基因敲除猪作为异种心脏瓣膜供体: 张润洁王荣根方斌李楚陈雷任雪洋厉小雪熊强张立宁金永张曼玲刘晓蕊王盈杨海元李荣凤戴一凡

P53正向细胞凋亡调控因子抑制剂对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用: 2014年; P53正向细胞凋亡调控因子(P53 upregulated modulator of apoptosis,PUMA)是Bcl-2家族唯BH3结构域亚家族成员,位于线粒体内,可被多种损伤因素诱导激活。PUMA通过BH3结构域与Bcl-2样抗凋亡蛋白结合后发挥其促凋亡作用。PUMA抑制剂模拟蛋白间的结合作用,阻碍PUMA与Bcl-2样蛋白结合,凋亡被抑制。在体内,依小鼠肝脏缺血、再灌注时间不同,损伤情况各异。损伤较轻时,PUMA表达升高,PUMA抑制剂能够保护肝脏抵抗损伤;当损伤较严重时,PUMA表达升高不明显,PUMA抑制剂的保护作用也不明显。综合上述,在一定程度损伤的条件下,PUMA抑制剂可以有效地保护肝脏,减轻损伤。; 王炎任子健王荣根胡菲菲程俊霖张正卫杨海元王盈余健戴一凡; 关键词：凋亡肝脏缺血再灌注阿霉素小鼠胚胎成纤维细胞

OSBPL2基因缺陷型巴马小型猪肥胖相关特征的分析被引量：1: 2020年; 目的:分析氧化固醇结合样蛋白2(oxysterol binding protein-like 2,OSBPL2)基因缺陷型巴马小型猪肥胖相关的表型特征和可能机制。方法:将3月龄野生型(wild type,WT)和OSBPL2缺陷型(mutant type,MT)巴马小型猪饲喂高脂饲料(high fat diet,HFD)。喂食9个月后检测体重、皮下脂肪厚度,HE染色观察肝脏脂肪变性,电镜观察肝脏组织亚细胞结构,检测血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶等生化指标,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测肝脏脂肪合成分化相关基因的变化,Western blot及免疫组织化学法检测脂肪酸结合蛋白4(adipocyte fatty acid binding protein 4,FABP4)及酰基辅酶A氧化酶1(acylcoenzyme A oxidase 1,ACOX1)蛋白表达水平。结果:MT-HFD组体重、皮下脂肪厚度明显高于WT-HFD组(P<0.05);HE染色结果显示,MT-HFD组脂肪细胞显著增大(P<0.001);MT-HFD组肝脏脂肪空泡变性明显多于WT-HFD组。qRT-PCR、Western blot及免疫组织化学染色结果发现,MT-HFD组肝组织中FABP4蛋白含量明显增加,ACOX1蛋白明显减少;电镜结果显示MT-HFD组肝脏线粒体相关内质网膜长度变短。结论:OSBPL2缺陷引起巴马小型猪肥胖相关表型特征,可能与抑制脂肪酸β-氧化、影响能量代谢平衡及促进脂肪分化有关。; 王天明曾华沙王盈杨海元姚俊鲁雅洁魏钦俊曹新戴一凡; 关键词：基因敲除肥胖

GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的巴马小型猪PFFs细胞系的建立被引量：1: 2019年; 目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪胚胎成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)/β-1,4 N-乙酸氨基半乳糖转移酶(β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase,β4GalNT2)双基因敲除细胞系,为构建α-1,3-半乳糖(α-1,3-galactose,α-Gal)和SD(a)抗原缺失的巴马小型猪模型奠定基础。方法分别选取猪GGTA1基因的第三外显子和β4GalNT2基因的第八外显子为敲除靶点,利用在线工具(http://crispr.mit.edu)设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以含有Cas9基因的pX330质粒为骨架构建打靶载体,转染野生巴马小型猪的PFFs,用T7EN1酶切验证打靶载体敲除效率。将打靶载体与G418抗性质粒(tdTomato)共转染巴马小型猪PFFs,经药物筛选获得阳性单细胞克隆后测序鉴定基因型。结果成功构建靶向GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体。转染PFFs后用药物筛选得到31个单克隆细胞系,其中5个为GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的细胞系。结论Cas9/sgRNA表达载体可以高效编辑PFFs的GGTA1/β4GalNT2基因并获得了双基因敲除的单细胞克隆,为构建GGTA1/β4GalNT2敲除的巴马小型猪提供必需的实验材料。; 厉小雪李楚任雪洋王盈杨海元戴一凡; 关键词：巴马小型猪

利用CRISPR/Cas9技术构建ACE2基因修饰的猪胎儿成纤维细胞系: 2022年; 目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)基因编辑的长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为构建新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2,SARS-CoV-2)不易感猪模型提供实验材料。方法:(1)利用生物信息学方法对大鼠和鸡的ACE2氨基酸序列进行比对,将大鼠ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白相互作用的关键氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基,设计嵌合的ACE2基因并构建ACE2基因敲入供体。(2)设计并合成靶向猪ACE2基因的sgRNA,克隆到p X330载体上构建ACE2基因打靶载体。(3)将ACE2打靶载体和ACE2基因敲入供体以及Neomycin抗性质粒共转染至长白猪PFF细胞,筛选G418抗性单细胞克隆并进行测序鉴定。结果:根据氨基酸序列比对结果,将大鼠ACE2蛋白的第19、31、34、35、42、353、354位氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基,设计合成了嵌合的ACE2基因。G418抗性单细胞克隆基因型分析结果显示获得了阳性单细胞克隆。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源ACE2基因敲除、嵌合ACE2敲入的长白公猪PFF细胞系,为构建SARS-CoV-2不易感猪模型奠定了基础。; 张成霖方斌刘晓蕊李琳王盈杨海元戴一凡; 关键词：ACE2

稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立被引量：1: 2016年; 目的 :建立可以稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)系。方法:优化核转染方法后,将RFP表达载体p EF1α-Ds Red-Express2导入h ESCs中。利用碱性磷酸酶染色、RT-PCR、免疫荧光染色和类胚体形等方法,比较核转染前后h ESCs的干细胞特性。结果:核转染后h ESCs的碱性磷酸酶染色结果为阳性。核转染前后h ESCs的Oct4、Sox2、Klf4、Nanog基因的表达未出现明显差异。RFP-h ESCs具有三胚层分化潜能,并且可稳定传30代以上。结论:成功建立稳定表达红色荧光蛋白的h ESCs,干细胞特性不受RFP的影响,可用于后续的实验研究。; 胡菲菲张纬欧阳琦王荣根李泽王冠王盈杨海元戴一凡; 关键词：人胚胎干细胞红色荧光蛋白

人/猪SERPING1同源性比较及猪SERPING1敲除细胞系的建立: 2022年; 目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶点,设计并合成靶向猪SERPING1的单导向RNA(sgRNA),连接到含有Cas9核酸内切酶的pX330载体上,构建SERPING1打靶载体pX330sgRNA,将其转染至猪胎儿成纤维细胞中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,用T7E1酶切实验检测靶点编辑情况,测序验证单克隆细胞基因型。结果生物信息学分析结果提示人/猪SERPING1蛋白氨基酸同源性较高,氨基酸比对相似性达到65.87%。成功构建打靶SERPING1的载体,并转染到细胞,药物筛选获得SERPING1基因敲除的单克隆细胞,测序确认了突变的基因型。结论人/猪SERPING1蛋白同源性较高,适合用于构建遗传性血管性水肿模型。构建的Cas9/sgRNA表达载体实现了SERPING1基因编辑,获得基因敲除的单细胞克隆,为后续SERPING1-/-猪模型的构建提供了必需的实验材料。; 王蒙朱晓晗刘晓蕊李琳王盈杨海元戴一凡

CRISPR/Cas9载体组合在制备基因敲除猪的血液制品中的应用: 本发明公开了CRISPR/Cas9载体组合在制备基因敲除猪的血液制品中的应用，所述基因敲除猪为敲除了GGTA1基因、CMAH基因和β4GalNT2基因的猪，所述CRISPR/Cas9载体组合包括GGTA1‑CRISPR/...; 戴一凡杨海元王盈; 文献传递

利用CRISPR/Cas9技术高效构建巴马小型猪F9基因敲除细胞系被引量：1: 2022年; 目的:利用CRISP/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪F9基因敲除的胚胎成纤维(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为后续构建血友病乙巴马小型猪模型提供原材料。方法:首先通过生物信息学方法对人和猪F9基因同源性进行分析,模拟并分析人和猪FⅨ二级、三级结构的相似性;其次选取猪F9基因的第2外显子为敲除靶点,利用CRISPR在线靶点设计工具(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)设计并合成单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为骨架构建打靶载体,同G418抗性质粒一同转染至野生巴马小型猪的PFF中,经药物G418筛选获得抗性单细胞克隆,测序并鉴定其基因型。结果:生物信息学分析表明人和猪的F9基因具有较近的遗传距离,FⅨ的氨基酸序列相似值为83.33%,三维结构的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)值为0.149。成功构建打靶载体并转染PFF细胞,药筛后共获得55个单细胞克隆,经过测序显示有25个单细胞克隆的F9基因发生突变,计算敲除率为45.5%。结论:人和猪F9基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA表达载体可以高效编辑PFF中的F9基因。最终获取F9基因敲除的单细胞克隆,为构建乙型血友病巴马小型猪模型奠定了重要的前期工作基础。; 朱晓晗刘晓蕊李琳王盈杨海元戴一凡; 关键词：血友病乙

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