刘晓蕊
- 作品数：18 被引量：8H指数：1
- 供职机构：南京医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金长三角科技联合攻关项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学文化科学更多>>
- 利用CRISPR/Cas9技术高效构建巴马小型猪F9基因敲除细胞系被引量：1
- 2022年
- 目的:利用CRISP/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪F9基因敲除的胚胎成纤维(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为后续构建血友病乙巴马小型猪模型提供原材料。方法:首先通过生物信息学方法对人和猪F9基因同源性进行分析,模拟并分析人和猪FⅨ二级、三级结构的相似性;其次选取猪F9基因的第2外显子为敲除靶点,利用CRISPR在线靶点设计工具(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)设计并合成单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为骨架构建打靶载体,同G418抗性质粒一同转染至野生巴马小型猪的PFF中,经药物G418筛选获得抗性单细胞克隆,测序并鉴定其基因型。结果:生物信息学分析表明人和猪的F9基因具有较近的遗传距离,FⅨ的氨基酸序列相似值为83.33%,三维结构的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)值为0.149。成功构建打靶载体并转染PFF细胞,药筛后共获得55个单细胞克隆,经过测序显示有25个单细胞克隆的F9基因发生突变,计算敲除率为45.5%。结论:人和猪F9基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA表达载体可以高效编辑PFF中的F9基因。最终获取F9基因敲除的单细胞克隆,为构建乙型血友病巴马小型猪模型奠定了重要的前期工作基础。
- 朱晓晗刘晓蕊李琳王盈杨海元戴一凡
- 关键词：血友病乙
- 胚胎免疫荧光染色操作皿及其制备方法
- 本发明公开了胚胎免疫荧光染色操作皿及其制备方法。胚胎免疫荧光染色操作皿包括操作皿和以琼脂糖凝胶制成的底衬；底衬贴附在操作皿的内腔底面，底衬上表面设有凹坑。其中，凹坑为半圆形。制备方法是（1）将设有半圆形凸起的模具固定在培...
- 蒲勇刘晓蕊刘亚曹鸿国张运海方富贵李运生卞雅妮王张凡张飞杨盼
- 文献传递
- 利用CRISPR/Cas9技术构建ACE2基因修饰的猪胎儿成纤维细胞系
- 2022年
- 目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)基因编辑的长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为构建新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2,SARS-CoV-2)不易感猪模型提供实验材料。方法:(1)利用生物信息学方法对大鼠和鸡的ACE2氨基酸序列进行比对,将大鼠ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白相互作用的关键氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基,设计嵌合的ACE2基因并构建ACE2基因敲入供体。(2)设计并合成靶向猪ACE2基因的sgRNA,克隆到p X330载体上构建ACE2基因打靶载体。(3)将ACE2打靶载体和ACE2基因敲入供体以及Neomycin抗性质粒共转染至长白猪PFF细胞,筛选G418抗性单细胞克隆并进行测序鉴定。结果:根据氨基酸序列比对结果,将大鼠ACE2蛋白的第19、31、34、35、42、353、354位氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基,设计合成了嵌合的ACE2基因。G418抗性单细胞克隆基因型分析结果显示获得了阳性单细胞克隆。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源ACE2基因敲除、嵌合ACE2敲入的长白公猪PFF细胞系,为构建SARS-CoV-2不易感猪模型奠定了基础。
- 张成霖方斌刘晓蕊李琳王盈杨海元戴一凡
- 关键词：ACE2
- 适于羊的动物胚胎收集管
- 本实用新型公开了一种适于羊的动物胚胎收集管，由细长管、软管和粗管组成；细长管为平头细长管，细长管的后部与软管的一端连接，软管的另一端与粗管连接。本实用新型作为在羊胚胎移植中冲胚时用于胚胎收集的工具，其具有结构简单，使用方...
- 李运生韩春杨张运海章美玲随刘才曹鸿国章孝荣刘亚张远亮焦明慧季索菲贾晴张宇桂涛周娜汝刘晓蕊杨盼张子军丁建平
- 文献传递
- 人/猪SERPING1同源性比较及猪SERPING1敲除细胞系的建立
- 2022年
- 目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶点,设计并合成靶向猪SERPING1的单导向RNA(sgRNA),连接到含有Cas9核酸内切酶的pX330载体上,构建SERPING1打靶载体pX330sgRNA,将其转染至猪胎儿成纤维细胞中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,用T7E1酶切实验检测靶点编辑情况,测序验证单克隆细胞基因型。结果生物信息学分析结果提示人/猪SERPING1蛋白氨基酸同源性较高,氨基酸比对相似性达到65.87%。成功构建打靶SERPING1的载体,并转染到细胞,药物筛选获得SERPING1基因敲除的单克隆细胞,测序确认了突变的基因型。结论人/猪SERPING1蛋白同源性较高,适合用于构建遗传性血管性水肿模型。构建的Cas9/sgRNA表达载体实现了SERPING1基因编辑,获得基因敲除的单细胞克隆,为后续SERPING1-/-猪模型的构建提供了必需的实验材料。
- 王蒙朱晓晗刘晓蕊李琳王盈杨海元戴一凡
- 生长素对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响及其受体基因的表达模式
- 2015年
- 为探明生长素及其受体GHSR-1a在胚胎早期发育中的作用,以猪孤雌激活胚胎为研究对象,在其体外发育过程中添加不同浓度生长素,观察胚胎发育速度和发育效率,并用荧光定量PCR检测猪孤雌激活胚胎早期发育过程中生长素特异性受体基因GHSR-1a的表达。结果显示,相对于对照组,添加10.0 mg/L生长素可以显著提高4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、桑葚胚的发育率(P<0.05),并能加快4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、桑葚胚的发育速度(P<0.05)。GHSR-1a mRNA在2-细胞期到桑葚胚期保持较高表达水平,囊胚期后显著下降(P<0.05);免疫荧光染色表明GHSR-1a在猪孤雌激活胚胎各发育时期均有表达,4-细胞期、8-细胞期和桑葚胚期的表达量显著高于囊胚期(P<0.05)。推测生长素通过提高GHSR-1a的表达来提高猪孤雌激活胚胎的发育速度和效率。
- 李运生童彬彬刘晓蕊凌英会方富贵张运海刘亚
- 关键词：生长素
- GGTA1/CMAH/β4GalNT2三基因敲除猪作为异种心脏瓣膜供体
- 张润洁王荣根方斌李楚陈雷任雪洋厉小雪熊强张立宁金永张曼玲刘晓蕊王盈杨海元李荣凤戴一凡
- α-半乳糖苷酶A基因敲除猪胎儿成纤维细胞系的建立
- 2022年
- 目的 基于CRISPR/Cas9技术构建α-半乳糖苷酶A (GLA)基因敲除的巴马公猪胎儿成纤维细胞(PFFs),为构建人类Fabry病猪模型提供实验材料。方法 利用生物信息学方法对人/猪GLA基因编码的α-Gal A的相似性进行分析,并鉴定出猪α-Gal A的催化残基位置。通过在线工具在编码催化残基之前的外显子区设计单链向导RNA,构建CRISPR/Cas9打靶载体。将打靶载体与抗性质粒共转染至巴马公猪胎儿PFFs,用G418药物筛选出单克隆细胞,并PCR测序鉴定。结果 人/猪α-Gal A的氨基酸序列一致性为81%,相似性为89%;三维结构的均方根偏差值为0.012。猪α-Gal A的催化残基是第174位和第235位的天冬氨酸。成功构建CRISPR/Cas9打靶载体,并筛选出单克隆细胞,PCR测序鉴定其基因型。结论 用生物信息学方法验证了人/猪α-Gal A具有高度的相似性。利用CRISPR/Cas9技术获得了GLA基因敲除的巴马公猪PFFs细胞系,为构建人类Fabry病猪模型奠定了基础。
- 冷允俊刘晓蕊李琳王盈杨海元戴一凡
- 关键词：FABRY病Α-半乳糖苷酶A
- 一种用于胚胎免疫荧光染色的新载体
- 2013年
- 用铝塑泡罩包装板在即将凝固的不同浓度琼脂糖(2%、3%、4%、5%)溶胶板上压制小孔,用作胚胎免疫染色操作载体,比较以琼脂糖凝胶孔为载体和以一次性细胞培养皿为载体进行胚胎免疫染色的效果。结果表明,以琼脂糖凝胶孔作为载体进行胚胎免疫荧光染色与传统载体染色效果相同,但避免了操作过程中由于胚胎与载体的黏附而造成的诸多不便;以3%琼脂糖凝胶孔为载体孔内液体损失率最小;琼脂糖凝胶板在4℃保存至少两周不影响其使用效果,并可反复使用。琼脂糖凝胶孔较传统载体更适于进行胚胎免疫荧光染色。
- 刘晓蕊万小凤蒲勇蒲勇刘亚莉李巧丹章美玲刘亚莉刘亚
- 关键词：胚胎免疫荧光染色琼脂糖凝胶
- GGTA1/β4GalNT2双基因敲除近交系五指山小型猪的建立被引量：6
- 2019年
- 目的:利用CRISPR/Cas9技术建立五指山小型猪近交系GGTA1/β4GalNT2双基因敲除克隆猪。方法:设计合成靶向猪GGTA1和β4GalNT2基因的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为骨架,分别构建GGTA1和β4GalNT2的Cas9打靶载体,转染至近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)中,通过G418药物筛选和测序鉴定获得双基因敲除的单细胞克隆,然后利用体细胞克隆技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT)获得双基因敲除的近交系五指山小型猪,并利用流式细胞技术检测克隆猪外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中αGal和Sd(a)抗原的表达。结果:成功构建GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得双基因敲除的近交系五指山小型猪PFF细胞克隆9个。SCNT成功获得了10只五指山小型猪近交系双基因敲除的克隆猪,其PBMC无αGal和Sd(a)抗原的表达。结论:CRISPR/Cas9技术可以实现对猪GGTA1/β4GalNT2基因的编辑。本实验首次成功制备了GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的近交系五指山型猪,为异种器官移植研究与应用提供了新的供体材料。
- 李楚任雪洋李琳厉小雪金永张曼玲刘晓蕊熊强张立宁王盈李荣凤杨海元冯书堂戴一凡
- 关键词：异种移植
