段晓雷
- 作品数：11 被引量：22H指数：2
- 供职机构：西北农林科技大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中国博士后科学基金博士后科研启动基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学更多>>
- 脆弱拟杆菌Pif1解旋酶的表达纯化与晶体生长被引量：2
- 2021年
- 获得可用于X射线衍射的B.f Pif1单晶以用于探究B.f Pif1结构与功能。构建原核表达载体pET15b-SUMO-B.f Pif1,并进行B.f Pif1重组蛋白的诱导表达;经镍柱亲和层析、SUMO酶切、DEAE交换层析与S200凝胶过滤层析等一系列纯化;并利用Stopped-flow技术检测纯化蛋白的活性;使用结晶机器人及多种试剂盒进行结晶条件筛选与优化培养,并进行初步的X射线衍射分析。获得高纯度(>98.5%)与高浓度(17 mg/mL)的B.f Pif1蛋白,动力学结果显示其解旋活性良好。结晶实验表明:在0.1 mol/L Bis-Tris乙酸(pH 8.3),0.05 mol/L碳酸氢钠,5%甘油和0.015 mol/L亚精胺条件下培养出形态较好的单晶,其X射线衍射分辨率达到3.5?。成功表达纯化与结晶培养出具有较高分辨率的B.f Pif1蛋白的单晶。
- 曹汝菲李泽轩许欢张莎张敏敏戴枫段晓雷
- 关键词：脆弱拟杆菌
- 嗜热厌氧杆菌Ana.Pif1解旋酶核心结构域蛋白与DNA底物结合的反应特性被引量：2
- 2018年
- 目的:探究嗜热厌氧杆菌的Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白(Ana. Pif1-HD)与DNA底物结合的反应特性。方法:利用DNAman、Cluxtal X等软件,对Ana. Pif1的核心结构域蛋白进行系统进化树分析与同源序列比对; Ana. Pif1-HD表达载体构建后转入大肠杆菌进行原核表达,并通过Ni-NTA、SUMO酶切、S200分子筛等层析柱纯化获得Ana. Pif1-HD蛋白;利用Stopped-flow FRET技术监测Ana. Pif1-HD蛋白的解旋活性,利用荧光偏振检测技术分析Ana. Pif1-HD与不同长度、不同结构DNA底物的结合反应各向异性值,并进行拟合分析与统计。结果:Ana. Pif1的核心结构域蛋白为靠近N-端的448氨基酸,通过原核表达与纯化获得纯度为97%、浓度为5 g/L的Ana. Pif1-HD蛋白,并利用Stopped-flow FRET与荧光偏振等技术验证其具有Ana. Pif1全长蛋白90%的解旋活性与95%的结合活性; Ana. Pif1-HD的最佳结合反应条件是42℃在pH 6. 0含20 mmol/L Na Cl及3 mmol/L MgCl2的溶液中进行; Ana. Pif1-HD与不同长度ss DNA底物结合时的解离速率常数递增,并明确其ssDNA的binding-size为10. 34 nt;研究首次揭示Ana. Pif1-HD与不同复制中间体DNA结合反应的底物特异性ssG4 DNA> G4 DNA> 3'-ssDNA-dsDNA≈Y-型>其它底物。结论:成功表达纯化具有全长活性的Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白,首次揭示该解旋酶核心蛋白与各类不同DNA底物的结合反应特性。
- 段晓雷段晓雷姚淼曾洁申丽刘娜女刘娜女肖代敏
- 淡色库蚊氯菊酯抗性相关基因PR-OP全长cDNA的克隆及生物信息学分析被引量：10
- 2010年
- 【目的】克隆淡色库蚊氯菊酯抗性相关视蛋白基因,并进行生物信息学分析,为阐明视蛋白基因的抗性机制及研制新型卫生杀虫剂奠定基础。【方法】依据库蚊抗性与敏感品系差异表达的EST片段设计PCR引物,采用RACE技术克隆淡色库蚊氯菊酯抗性相关基因PR-OP全长cDNA序列,并对其生物信息学进行分析。【结果】获得了长度为1 402 bp的淡色库蚊氯菊酯抗性相关基因PR-OP全长cDNA,其编码383个氨基酸。生物信息学分析结果表明,该基因编码蛋白为具有7个跨膜螺旋的膜蛋白,其保守域与视紫红质家族的保守域一致,该蛋白还具有2个信号肽切割位点和18个磷酸化位点。系统进化分析表明,该基因与淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关视蛋白基因及致倦库蚊、埃及伊蚊视紫红质基因氨基酸序列同源性在69%以上,与家蚕、烟草天蛾、柞蚕、柑橘凤蝶、中华蜜蜂、黑腹果蝇视蛋白的氨基酸序列同源性均在56%以上。【结论】克隆了淡色库蚊氯菊酯抗性相关视蛋白基因(GenBank登录号为FJ917744),推测其与氯菊酯抗性相关。
- 刘虎岐刘应保宋云鹏段晓雷程鸟鸟
- 关键词：淡色库蚊氯菊酯生物信息学分析
- 不同方法提取淡色库蚊总RNA的定量比较分析被引量：3
- 2012年
- 采用异硫氰酸胍法、Trizol法、Trizol改良法、CTAB法及Trizol+CTAB 5种方法提取的淡色库蚊总RNA,以期得到最优方法。提取总RNA并用电泳及紫外分光光度计检测,经过Dnase I消化后反转录成cDNA,以此为模板,用CYP6F1引物作定量表达分析。结果表明,与其他几种方法相比,CTAB法提取的效果最好,提取的样品纯度高,完整性好,杂质较少,DNA残留少,降解不明显。CTAB法提取的RNA可以作为cDNA合成和基因克隆的模板,能够满足后续研究的需要。
- 温雪梅段晓雷刘虎岐
- 关键词：淡色库蚊抗药性总RNA提取
- 蚊耐氯菊酯C6/36细胞构建及耐药相关基因PR-XP1的表达分析
- 2014年
- 建立蚊耐氯菊酯C6/36细胞,并探讨PR-XP1基因与蚊C6/36细胞对氯菊酯的耐药性之间关系。采用逐步诱导法筛选蚊耐氯菊酯C6/36细胞,观察耐药细胞形态变化、生长状态,测定生长曲线和半数致死剂量;利用荧光实时定量PCR鉴定PR-XP1基因在敏感细胞与耐药细胞中的表达差异。获得耐400μg/m L氯菊酯的C6/36细胞;实时定量PCR检测发现抗药基因PR-XP1在蚊耐氯菊酯C6/36细胞中表达量明显上升。表明构建蚊耐氯菊酯C6/36细胞是研究蚊虫氯菊酯耐药性的有效方法,初步证明PR-XP1基因表达升高可能与蚊虫对氯菊酯的耐药性具有一定的相关性。
- 刘娜女段晓雷赵飞刘虎岐
- 关键词：C6/36细胞氯菊酯
- Pif1解旋酶解旋G4 DNA分子机制的研究
- 鸟苷酸-四联体结构(G-quadruplex DNA,简称G4 DNA)是一种富含鸟苷酸(G)序列的四链形态的DNA二级结构,它在胞体内可以发挥各种各样的功能,如维持端粒稳定,参与DNA复制起始调控等。如果解旋G4结构失...
- 段晓雷
- 文献传递
- 嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶生物学活性的分子特征分析被引量：2
- 2018年
- 已知Pif1解旋酶在维持基因组稳定性方面发挥重要作用,且不同生物Pif1解旋酶具有不同的生物学活性;然而迄今为止,嗜热细菌Pif1解旋酶的生物学活性分子特征的研究尚未见报道。本文运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶(Defe.Pif1)结合活性与解旋活性的分子特征。通过原核表达纯化系统,本研究获得纯度95%以上、无标签的Defe.Pif1蛋白。利用荧光偏振技术研究Defe.Pif1结合反应的底物特异性,揭示出Defe.Pif1优先结合ss DNA与G4 DNA,并对含3'-尾链的部分双链底物有较强亲和力,其结合反应底物特异性为:ss DNA>G4 DNA>3'-ss DNA-ds DNA≈Y-structure>Other substrates。通过快速停留检测技术研究Defe.Pif1的解旋活性,明确其最适解旋温度为50℃,最佳反应溶液为10 mmol/L Na Cl、3mmol/L DTT、3 mmol/L Mg Cl2及1 mmol/L ATP;进一步的解旋动力学特征分析结果显示,Defe.Pif1可以高效解旋含G4结构的DNA底物,其解旋5'-G4-ds DNA底物时的解旋幅度超过90%,解旋速率也与其解旋5'-ss-ds DNA底物的速率相近,提示Defe.Pif1解旋G4 DNA更接近Bs.Pif1的单体反应模式。此外,本研究还发现Defe.Pif1解旋不同类型复制叉/复制泡底物时拥有独特的解旋倾向性:与解旋其它复制中间体DNA的低效性不同,Defe.Pif1解旋12nt-bubble底物的速率与幅度均较高,暗示12nt-bubble结构很可能是该解旋酶复制中间体的天然底物。上述结果证明,Defe.Pif1不仅具有Pif1解旋酶家族成员共同的结合与解旋G4 DNA等活性特征;而且作为嗜热细菌的解旋酶,它还具有独特的反应条件与解旋底物特异性。本研究为研究Pif1解旋酶家族其它成员的分子特征与生物功能提供了潜在的研究策略,为阐明此类Pif1解旋酶的分子作用机制奠定实验基础。
- 段晓雷段晓雷刘娜女闵迅闵迅
- PR-XP1基因的克隆及在C6/36耐药细胞株中抗性的初步研究
- 蚊虫作为全球广泛分布的最主要的医药害虫,传播多种致命疾病,严重威胁人类的健康。目前防控蚊虫危害的主要手段仍是化学防治;其中又以拟除虫菊酯类杀虫剂的使用最为广泛;然而其大量、长期的使用已使蚊虫产生了越来越严重的抗药性。因此...
- 段晓雷
- 关键词：淡色库蚊RACE生物信息学分析耐药细胞株
- 文献传递
- 厌氧棒菌Pif1解旋酶的表达纯化及解旋条件优化被引量：2
- 2017年
- 【目的】通过原核表达系统获得嗜热的厌氧棒菌(Anaerobaculum hydrogeniformans)DNA解旋酶Pif1(AnaPif1),研究其体外最佳解旋条件,为深入研究嗜热菌Pif1家族解旋酶工作机理提供参考。【方法】构建重组载体pET15b-sumo-AnaPif1,将重组载体转入表达菌株BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA柱和Heparin柱纯化最终获得全长AnaPif1蛋白;利用停流-荧光共振能量转移(FRET)技术,以pH值和Tris-HCl、NaCl、MgCl_2浓度及反应温度、能量供体为考察因素,以反应时间常数或速率常数为指标,摸索该蛋白在体外的最佳解旋条件、最佳能量供体以及底物的偏好性。【结果】成功构建了pET15b-sumo-AnaPif1重组表达载体,通过诱导表达,获得了纯度大于95%的全长AnaPif1蛋白,其大小为55ku,等电点为6.89。AnaPif1在体外的最佳解旋条件为:Tris-HCl(pH7.0)20mmol/L、NaCl 20mmol/L、MgCl_22mmol/L、反应温度37℃;其能够利用4种核苷三磷酸(ATP/GTP/CTP/UTP)作为能量供体,但对ATP有偏好性;该酶还能解旋多种底物(双链DNA、G4-DNA),且对底物选择无明显偏好性。【结论】获得了纯化的AnaPif1解旋酶,明晰了其最佳解旋条件、能量供体及底物的偏好性特征。
- 郭海磊刘娜女段晓雷奚绪光
- 关键词：蛋白表达纯化
- 嗜热细菌Anaerobaculum hydrogeniforman Pif1解旋酶的异源表达与解旋反应特性被引量：1
- 2019年
- 【目的】原核表达与纯化源自嗜热细菌Anaerobaculum hydrogeniforman的Pif1解旋酶,从而探究其解旋反应特性。【方法】将重组载体pET21a-AnaPif1-TEV/SUMO导入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并进行Ni-NTA亲和层析、Superdex200凝胶过滤层析等一系列纯化手段;再利用快速停留监测技术系统地研究Ana.Pif1的解旋反应特性,包括解旋极性、最佳ATP浓度、最佳金属辅因子、最佳解旋温度以及解旋复制中间体DNA的底物特异性。【结果】通过异源表达与纯化,获得了无任何标签序列、分子量59 kDa的Ana.Pif1蛋白,纯度达97%,产率为9.5 mg/L。本研究首先验证Ana.Pif1具有5''-3''的解旋极性,并发现其解旋反应最佳ATP浓度为2 mmol/L,其最佳二价金属辅因子为Mg^(2+),最适反应温度为55°C。解旋复制中间体的底物特异性显示,Y-S型复制叉的解旋速率最高,为0.127s^(–1);而12 nt-bubble底物的解旋幅度最大,达到78.8%;暗示这些底物可能是Ana.Pif1的天然底物。【结论】本文首次较为系统地分析了Ana.Pif1解旋酶的解旋反应特性,为阐明此类嗜热细菌Pif1解旋酶的分子作用机制奠定了基础。
- 段晓雷段晓雷刘娜女张涛姜钧耀闵迅闵迅
