韩冬梅
- 作品数：31 被引量：53H指数：5
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- 基于膜受体阻断犬细小病毒感染的分子机制研究
- 仲飞李秀锦仲峰李文艳王微温洁霞潘素敏潘红丽李楠王幸兴韩冬梅王利月林洪羽张永红张建楼
- 基于细小病毒VP2蛋白与宿主细胞膜TfR特异结合并介导病毒感染的特性，利用宿主细胞的TfR细胞外区（也称可溶性的TfR，即sTfR）重组蛋白封闭细小病毒颗粒，从而达到阻止细小病毒感染宿主细胞的目的。在项目研究过程中，课题...
- 关键词：
- 关键词：细小病毒感染分子生物学
- 大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基K63突变体表达载体的构建及其在真核细胞中的表达被引量：1
- 2009年
- 采用PCR方法从产肠毒素大肠杆菌（ETEC）44815菌株基因组中扩增不耐热肠毒素A亚基（LTA）编码基因，并将大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因插入到含有人CD5信号肽序列的pcDNACD5sp真核表达载体中，构建成pcDNACD5sp／LTA分泌性真核表达载体，然后采用定点突变方法将大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基第63位的丝氨酸改变为赖氨酸，构建成pcDNACD5sp／LTAK63突变体，经磷酸钙介导将pcDNACD5sp／LTAK63质粒转染HEK293T细胞进行表达。结果表明：试验克隆的大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因与GenBank中大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因序列相比，碱基序列、氨基酸序列同源性均达99％；表达产物经Western-blot检测，结果说明构建的含有人CD5信号肽的LTAK63基因能够在真核细胞中进行分泌性表达。
- 韩冬梅李秀锦李楠王微李巍潘素敏仲飞
- 关键词：大肠杆菌基因克隆定点突变真核表达
- 猪PRRSV受体唾液酸粘附素多克隆抗体的制备
- 2012年
- 唾液酸粘附素(Sialoadhesin,Sn)是猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的主要受体,研究该受体在PRRSV感染过程中的作用依赖于特异的抗体。为制备Sn的抗体,首先依据通过DNAstar软件分析的抗原指数,确定编码114个氨基酸的Sn抗原表位基因(Sn114),然后依据大肠杆菌偏爱的密码子对该基因进行密码子优化,并由公司合成。将合成的基因克隆到pET-32a(+)
- 李振仲飞李秀锦王幸兴韩冬梅张峰潘红丽
- 关键词：粘附素唾液酸抗体滴度密码子优化原核表达载体
- 绿脓杆菌ATCC27853菌株外毒素A全长编码基因的克隆及其在HEK293T细胞中的表达
- 采用 PCR 方法从绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853菌株基因组扩增绿脓杆菌外毒素 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)全长编码基因,并...
- 吴凌娟仲飞解民靳慧君王微韩冬梅
- 文献传递
- 猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达被引量：2
- 2009年
- 用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。
- 王微解民吴凌娟靳慧君韩冬梅仲飞
- 重组猪蛔虫抗菌肽cecropin P1在毕赤酵母中的表达及抑菌活性
- ＜正＞为在毕赤酵母中表达重组猪蛔虫抗菌肽cecropin P1,根据已发表的基因编码序列设计引物,采用RT-PCR方法从猪肠道蛔虫中扩增出cecropin P1基因,并将其插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信...
- 李巍仲飞李秀锦张峰刘龙飞王幸兴潘素敏韩冬梅
- 文献传递
- 人CD14信号肽介导卵清蛋白在HEK293T细胞的高效表达
- 2012年
- 本试验将人CD14信号肽序列与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)基因融合,旨在提高OVA在非输卵管上皮细胞中的表达。提取鸡输卵管上皮细胞总RNA,经反转录合成的cDNA,再利用修饰的特异性引物,通过PCR从cDNA中分别扩增出5'端与人CD14信号肽序列融合和非融合的OVA基因,并将它们分别插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成表达载体pcDNA-CD14sp-OVA和pcDNA-OVA。经磷酸钙介导,将质粒转染至HEK293T细胞,使其进行表达,用鼠抗OVA单克隆抗体通过免疫印迹(Western blot)法检测OVA表达水平。结果表明:本试验扩增的OVA基因序列与GenBank中的序列(登录号NM_205152)一致,构建的人CD14信号肽序列融合OVA基因的表达载体结构正确。经过在HEK293T细胞的表达,融合人CD14信号肽序列的重组蛋白OVA的表达水平明显得到提高。结果提示,融合人CD14信号肽序列后的重组蛋白OVA在非输卵管上皮细胞中的表达水平明显提高,为OVA基因作为DNA疫苗模式抗原的应用提供了必要的条件。
- 能昌爱李秀锦仲飞李振张峰陈慧慧张考韩冬梅
- 关键词：卵清蛋白重组蛋白表达
- 白细胞介素-12对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用被引量：6
- 2012年
- 犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平,本研究在小鼠体内尝试了利用白细胞介素12(IL-12)基因表达载体提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平。首先采用RT-PCR方法从小鼠脾淋巴细胞中分别扩增IL-12大亚基(P40)和小亚基(P35)cDNA基因;然后在真核表达载体pcDNA3.1A上通过引入内部核糖体进入位点(IRES)序列,分别将P40基因和P35基因插入到IRES序列的上下游,构建成IL-12(P40和P35双亚基)基因表达载体,pcDNA-P40-IRES-P35。将上述表达载体与本室构建的VP2表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导相应基因在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2载体单免疫和VP2载体和IL-12载体共免疫方法对小鼠进行免疫(用pcDNA3.1A作为对照)。免疫后在特定时间通过ELISA方法检测小鼠血清抗VP2蛋白的抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后35d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果表明,扩增的小鼠IL-12P40和P35亚基基因与GenBank的参考序列基本一致。Western-blot检测结果表明,重组IL-12和VP2均能够在HEK293T细胞中进行分泌性表达。ELISA检测结果表明利用IL-2载体与VP2载体共免疫小鼠,其血清中抗VP2的抗体水平明显高于VP2载体单免疫组(P<0.01),抗体水平在第35天高达1:5120。淋巴细胞增殖试验结果表明,免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组(P<0.01),VP2载体与IL2载体共免疫组的刺激指数明显高于VP2载体单免疫组(P<0.05)。由此可见,在小鼠体内,IL-12基因表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平。
- 潘素敏李秀锦仲飞柳新保韩冬梅王幸兴潘宏丽王微
- 关键词：IL-12细小病毒VP2基因DNA疫苗
- 大肠杆菌不耐热肠毒素的克隆、改造及表达
- 大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT）是肠产毒性大肠杆（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）分泌的一种热不稳定肠毒素，LT是由一个具有毒性的A...
- 韩冬梅
- 关键词：不耐热肠毒素免疫疫苗真核表达载体蛋白纯化
- 文献传递
- 犬白细胞介素-7基因对犬细小病毒DNA疫苗的免疫增强作用被引量：6
- 2012年
- 【目的】白介素-7是动物体一种重要的多功能细胞因子,在促进B细胞、T细胞的形成和发育,在协同其它细胞因子提高机体免疫能力等方面发挥重要作用。本试验利用犬细小病毒VP2 DNA疫苗,在小鼠体内分析了犬白介素-7(cIL-7)基因的免疫增强作用。【方法】采用RT-PCR方法从犬脾淋巴细胞中扩增cIL-7基因,然后将cIL-7基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,分别构建成与Myc/His标签融合和非融合的cIL-7真核分泌型表达载体pcDNA-cIL7/MH和pcDNA-cIL7。由磷酸钙介导将pcDNA-cIL7/MH质粒转染HEK 293T细胞使其进行瞬时表达,以Western-blot检测构建的表达载体能否介导cIL-7基因在真核细胞中进行分泌表达。用已构建的VP2表达载体pcDNA-CD5-VP2与pcDNA-cIL7载体共免疫小鼠,并设pcDNA-CD5-VP2单免疫小鼠和pcDNA-cIL7单免疫小鼠作为对照。免疫后通过ELISA方法检测抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验和ELISA方法分别检测免疫后35 d小鼠脾脏淋巴细胞刺激指数和γ-干扰素的表达水平。【结果】本试验扩增的cIL-7基因序列与GenBank中犬的序列完全一致。构建的表达载体能够介导cIL-7基因在HEK293T细胞中进行分泌表达。动物免疫试验结果显示,cIL-7与VP2共免疫组小鼠血清的抗体滴度和中和抗体效价分别极显著和显著高于VP2单免疫组(P<0.01和P<0.05);共免疫组小鼠淋巴细胞刺激指数和γ-干扰素表达水平也显著高于VP2单免疫组(P<0.05)。【结论】cIL-7基因可增强小鼠对VP2 DNA疫苗的免疫应答反应。
- 孙岩仲飞李秀锦王幸兴王璐贾启恒韩冬梅李振张峰潘红丽
- 关键词：细小病毒VP2基因DNA疫苗
