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刘凯: 作品数：14 被引量：34H指数：4; 供职机构：首都医科大学附属北京佑安医院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金首都卫生发展科研专项首都医学发展科研基金更多>>; 相关领域：医药卫生生物学文化科学更多>>

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成像流式细胞仪检测细胞自噬水平研究被引量：2: 2016年; 目的采用新型成像流式细胞仪量化检测细胞自噬水平,完善自噬检测手段。方法用绿色荧光蛋白(GFP)-微管相关蛋白轻链3(LC3)表达质粒转染Huh7细胞和H1299细胞,并进行24h饥饿处理,诱导自噬发生,分别用荧光显微镜拍照、蛋白免疫印迹法和成像流式细胞术3种方法检测细胞自噬水平。用IDEAS软件对成像流式细胞术的细胞自噬结果进行量化分析。结果荧光显微镜显示,Huh7细胞比H1299细胞中的自噬斑点少;蛋白免疫印迹法显示,与H1299细胞比较,Huh7细胞LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比例较低,但2种方法均不能获得通量统计数据。成像流式细胞仪结果显示细胞自噬图像,2种细胞的GFP-LC3质粒转染效率基本一致(25.2%和27.6%);比较两者发生高水平自噬(LC3斑点数目为6个以上)的细胞比例,Huh7细胞仅为9.0%,显著少于H1299细胞(26.2%)。结论采用新型成像流式细胞仪检测细胞自噬,兼具量化分析和成像的优点,能弥补荧光显微镜和蛋白免疫印迹法的不足,是一种更优秀的自噬检测方法。; 时景仁郭向华王珊珊刘凯乔录新张玉林陈德喜; 关键词：自噬

p53凋亡刺激蛋白2在HepG2.215细胞中通过抑制自噬来发挥抗乙型肝炎病毒的作用: 2018年; 目的研究p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)对乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBs Ag)和乙型肝炎E抗原(hepatitis Be antigen,HBe Ag)表达的影响。方法 HepG2. 215细胞用3-甲基腺嘌呤处理来抑制自噬,或用人ASPP2重组腺病毒感染来诱导ASPP2过表达,或转染GFP-LC3质粒后观察绿色LC3-Ⅱ颗粒(自噬标志物)的变化。酶联免疫吸附测定检测培养上清和胞内HBs Ag和HBe Ag的水平、免疫荧光检测LC3-Ⅱ颗粒的水平、免疫印记检测自噬相关蛋白的水平、免疫沉淀检测ASPP2与自噬相关蛋白的结合。结果 ASPP2过表达明显下调了绿色LC3-Ⅱ颗粒的水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比例、以及明显上调p62的水平,说明ASPP2过表达可抑制HepG2. 215细胞的自噬。但是ASPP2并非通过抑制Atg5、Atg14和Beclin-1等自噬相关基因的表达来抑制自噬,而是通过与Atg14结合来抑制Atg14与Beclin-1的结合,阻断自噬体膜的形成,从而抑制自噬。抑制自噬和ASPP2过表达均导致培养上清和细胞内的HBs Ag和HBe Ag水平明显下调,表明在Hep2. 215中,ASPP2通过抑制自噬来抑制HBs Ag和HBe Ag的产生。结论ASPP2通过抑制自噬的作用具有抗乙型肝炎病毒感染的潜力。; 刘东杰纪乐刘凯刘凯吴刚; 关键词：乙型肝炎病毒自噬

射频消融亚致死性温度对肝癌干细胞的影响被引量：1: 2017年; 目的研究亚致死温度射频消融(RFA)对肝癌干细胞(LCSC)产生及其相关转录因子表达的影响。方法利用小鼠Hep1-6肝癌细胞株和肝细胞癌(HCC)患者临床样品,检测LCSC相关标志物和转录因子的表达。结果不同温度分别刺激Hep1-6细胞后发现,45℃是不能诱导细胞死亡的亚致死性温度。流式细胞仪(FCM)检测显示45℃处理可引起CD13^+、CD44^+、CD90^+、CD133^+Hep1-6细胞水平明显上调,提示45℃温度导致Hep1-6细胞中以上各型LCSC产生增加;实时定量聚合酶链反应(RT-q PCR)检测显示45℃温度导致CD13、CD90、CD133 m RNA水平明显上调。CD13 m RNA水平在5例HCC患者复发肝癌组织中均明显上调,CD133 m RNA在4例复发肝癌中上调,CD90 m RNA仅在1例复发肝癌中上调;FCM检测显示CD13^+LCSC水平在4例复发肝癌中明显上调,CD133^+LCSC水平仅在1例复发肝癌中上调,提示CD13^+LCSC水平上调与45℃温度关系更密切。RT-q PCR检测显示4例CD13^+LCSC上调的复发肝癌患者13个LCSC相关转录因子中Sox2、Stat1明显上调,FCM检测显示45℃处理Hep1-6细胞后Sox2、Stat1 m RNA明显上调。用Sox2、Stat1 si RNA分别沉默了Sox2、Stat1基因,表明Sox2、Stat1均参与了45℃温度诱导的CD13^+LCSC产生。结论 RFA治疗中45℃亚致死性温度所致CD13^+LCSC水平增高与Sox2、Stat1表达有关。该结果对肝癌复发研究有一定借鉴意义。; 郝美君刘凯郭向华欧阳雅博乔录新石英陈德喜郑加生; 关键词：肝细胞癌射频消融肝癌干细胞

饥饿诱导DRAM介导的自噬与肝细胞凋亡的关系被引量：1: 2013年; 目的探讨在饥饿情况下,自噬与正常肝脏细胞凋亡的关系,及凋亡与损伤调节自噬调控基因(dam-age-regulated autophagy modulator,DRAM)介导的自噬之间的关系。方法采用无血清培养基培养正常肝脏细胞系7702细胞36h,采用M30免疫荧光染色观察凋亡,采用免疫印记检测自噬和DRAM基因的表达水平;并用DRAM特异的小干扰RNA(siRNA)阻断DRAM作用后,观察凋亡和自噬的水平。结果和0h相比,在12、24和36h3个时间点,饥饿可明显诱导7702细胞凋亡(P<0.001)。免疫印记结果显示,饥饿后第12、24和36小时的DRAM水平和自噬水平均逐渐增高,两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)。用DRAMsiRNA阻断DRAM功能后,在12、24和36h未检测到DRAM的表达,同时凋亡细胞数明显下降(P<0.05)。DRAMsiRNA阻断DRAM功能后,在12、24和36h的自噬水平无明显差异。结论 DRAM介导的自噬可导致正常肝脏细胞凋亡,其对凋亡的影响可能成为肝癌研究的新思路。; 刘凯姜涛王安娜温韬殷继明任峰时红波刘道洁乔录新李宁陈德喜; 关键词：凋亡自噬

饥饿诱导DRAM介导的自噬与HepG2和Hep3B细胞凋亡的关系被引量：1: 2013年; 目的探讨饥饿诱导损伤调节自噬调控基因(DRAM)介导的自噬在HepG2细胞和Hep3B细胞凋亡中的作用。方法 HepG2细胞和Hep3B细胞经饥饿处理后,观察DRAM的表达和自噬的发生;利用DRAM小干扰RNA(siRNA)阻断DRAM,观察饥饿诱导的自噬水平;采用Calcein AM/PI染色,观察DRAM siRNA对饥饿引起的细胞凋亡的影响。结果经饥饿处理后12、24、36h,HepG2细胞和Hep3B细胞内DRAMmRNA均显著高于处理前(P﹤0.001),细胞凋亡明显增加(P﹤0.01),但两种细胞系间细胞凋亡计数的差异无统计学意义。DRAM siRNA阻断DRAM的功能后,HepG2和Hep3B细胞自噬减少,但对饥饿引起的细胞凋亡没有明显影响。结论 DRAM参与了饥饿诱导的自噬,可能不是饥饿引起肝癌细胞凋亡的机制。; 殷继明刘凯温韬张超刘道洁乔录新任峰王安娜李宁陈德喜; 关键词：自噬凋亡

早期自噬在非酒精性脂肪肝中的保护作用被引量：14: 2011年; 目的探讨非酒精性脂肪肝细胞模型中早期自噬的发生及作用。方法用含浓度为400μmol/L油酸的DMEM高糖培养基培养肝癌HepG2细胞,制作体外非酒精性脂肪肝细胞模型。向肝癌HepG2细胞转染GFP-LC3质粒,通过观察LC3Ⅱ绿色荧光斑点确定自噬的发生。采用PI3k抑制剂LY294002抑制自噬。CalceinAM和碘化丙啶(PI)对培养的细胞进行染色来确定活细胞和晚期凋亡细胞。荧光定量PCR确定促凋亡基因BAX的表达。结果油酸刺激的肝癌HepG2细胞在第8小时可以出现强烈的自噬反应,但未刺激细胞没有出现LC3Ⅱ绿色斑点。CalceinAM/PI染色未观察到第8小时出现晚期凋亡细胞。但通过LY294002抑制自噬后第8小时自噬水平明显下调,并且有7.8%的细胞出现晚期凋亡。荧光定量结果显示LY294002抑制自噬的第8小时BAX出现高表达。结论油酸刺激肝癌HepG2细胞的早期,自噬的发生可能对细胞有一定的保护作用,其机制可能与减少促凋亡基因的表达有关。; 刘凯徐树莹徐斌陈德喜李宁; 关键词：非酒精性脂肪肝自噬凋亡

晚期自噬在非酒精性脂肪肝中的促凋亡作用被引量：11: 2011年; 目的在非酒精性脂肪肝体外模型中研究油酸长期刺激对自噬的影响及其作用。方法用含浓度为400μmol/L油酸的DMEM高糖培养基培养肝癌HepG2细胞,制作体外非酒精性脂肪肝细胞模型。向肝癌HepG2细胞转染GFP-LC3质粒,通过观察LC3Ⅱ绿色荧光斑点确定自噬的发生。采用PI3k抑制剂LY294002抑制自噬。用抗M30抗体对培养的细胞爬片做免疫组化来确定凋亡细胞。荧光定量PCR确定凋亡相关基因BCL2和BAX的表达。结果油酸刺激肝癌HepG2细胞12h时自噬水平很低,36h后自噬水平再次显著升高。抗M30抗体免疫组化结果显示12h时肝癌HepG2细胞开始凋亡,至36h时有52%细胞出现凋亡。LY294002处理可使12h和36h的自噬消失,并且也明显减弱了凋亡的发生。凋亡相关基因BCL2和BAX的基因转录水平在油酸处理的12h和36h无显著性差异,LY294002处理也未引起两者转录的显著改变。结论油酸长期刺激肝癌HepG2细胞可以引起自噬介导的凋亡,但该凋亡发生的机制可能和BCL2/BAX基因转录水平的调节无关。; 刘凯徐树莹徐斌陈德喜李宁; 关键词：非酒精性脂肪肝自噬凋亡

自噬与肝癌被引量：7: 2011年; 自噬．又称细胞自我消化，是细胞为了自身的发展、分化、生存，维持稳态的一种生理过程。自噬可以清除细胞内长期存活的蛋白和损伤的细胞器．并使降解产物重新被细胞利用。最新研究显示．自噬的调节异常是人类恶性肿瘤病理过程中的一个新特征。现就自噬在肝癌中的作用综述如下。; 石文洁刘凯陈德喜李宁; 关键词：自噬肝癌细胞器生理过程长期存活病理过程

肝癌标志物高尔基体蛋白73基因在大肠杆菌中的表达被引量：2: 2011年; 目的克隆、表达和鉴定肝癌标志物高尔基体蛋A73（G1773）基因序列（1028～1327bp）。方法应用Biosun生物学软件分析GP73全序列，预测其抗原表位，将GP73蛋白基因克隆到表达载体PGEX-4T-2上，构建重组表达质粒PGEX-4T-2／GP73,转化大肠杆菌BL21，异丙基-β—D-硫代半乳糖吡喃糖苷（WFG）诱导表达，利用GST亲和层析柱对重组蛋白进行纯化．并用蛋白印迹分析技术（Western blot）和酶联免疫吸附测定方法（ELISA）检测其抗原性．并与商品化的GP73抗原进行比较。结果本研究纯化的GP73蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，SDS～聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）显示其相对分子质量为37kD，与预计大小一致。Western blot和ELISA实验证实，纯化的GP73蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了GP73序列．为制备抗体和肝癌诊断试剂的研发奠定了实验基础。; 张向颖刘芳谢立娄金丽刘凯陈德喜修冰水张贺秋; 关键词：高尔基体蛋白73 克隆表达

监测HBV rt181位点突变患者的外周血淋巴细胞分群和功能的意义: 2016年; 核苷及核苷酸类药物[Nucleos（t）ide analogs,NAs]能够直接抑制HBV复制,在临床广泛应用于治疗慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）。然而NAs抗病毒治疗中伴随的HBV基因突变造成了严重的耐药问题。HBV DNA反转录酶区（RT）在181位点的突变不仅会导致病毒对大部分NAs耐药，而且对病毒复制、蛋白分泌等都有影响。; 时景仁黄雁翔刘凯董培玲郭向华陈德喜; 关键词：HBV复制位点突变外周血淋巴细胞抗病毒治疗分群

刘凯

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