叶力
- 作品数：10 被引量：17H指数：2
- 供职机构：武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学化学工程更多>>
- HCV核心蛋白诱导Cos-7细胞凋亡被引量：3
- 2003年
- 将丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(Core)基因的全长序列插入到真核表达载体pCDNA3 CMV启动子下游,构建真核表达载体pCDNA3-Core,用脂质体LipoVec^(TM)转染Cos-7细胞系进行瞬时表达;DNA转染24h后用免疫斑点试验检测在细胞中表达的Core蛋白;转染72h后用Hoechst染色和DNA Ladder检测Cos-7细胞的凋亡情况;荧光染色观察到了细胞凋亡核碎裂,琼脂糖凝胶电泳也呈现出180-200bp整数倍的梯形带,呈现典型的细胞凋亡特征。这些结果表明HCV Core蛋白的表达能引起Cos-7细胞凋亡,Core蛋白的这种功能可能在HCV的持续感染过程中起着一定的作用。
- 佘应龙叶林柏廖庆姣叶力郭泰林杨晓骏
- 关键词：HCV核心蛋白细胞凋亡丙型肝炎病毒
- 精氨酸、精氨酸盐酸、半胱氨酸、胱氨酸对重组人tPA蛋白复性的影响被引量：2
- 2006年
- 以重组人tPA蛋白为材料研究了精氨酸、精氨酸盐酸盐、半胱氨酸、胱氨酸对蛋白质复性效果的影响,重组tPA蛋白包涵体经尿素变性溶解后,在精氨酸、精氨酸盐酸盐、半胱氨酸、胱氨酸存在的条件下进行复性,结果表明,碱性的精氨酸在质量分数0.2%时可减少蛋白质凝聚,显著提高复性效果,tPA复性后的活性可提高50%以上,半胱氨酸单独使用具有类似β-巯基乙醇的作用,精氨酸盐酸盐和胱氨酸单独使用对复性无影响,而半胱氨酸和胱氨酸联合使用,有类似氧化-还原系统作用。可提高活性20%。
- 吴正辉郜金荣佘应龙叶力叶林柏
- 关键词：复性
- 不同复性条件对重组人组织纤溶酶原激活剂复性的影响被引量：2
- 2008年
- 大肠杆菌生产菌株诱导表达产生的无活性重组人组织纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen acti-vator,tPA)包涵体蛋白,溶解于尿素中变性后进行复性.通过单因子试验和正交试验考察了不同复性条件下透析复性对tPA包涵体蛋白复性效率的影响.结果表明蛋白质浓度、复性温度、pH值、复性介质、还原剂浓度对tPA的复性效果都有不同程度的影响,当0.5 g/L tPA包涵体蛋白溶解于pH 9.5的7 mol/L的尿素,加入5 mmol/Lβ-巯基乙醇,在20℃、pH 8.0的双蒸水条件下复性时,可以取得最高的复性效率(2.0×107IU/g).通过对稀释复性、透析复性和凝胶过滤层析复性3种方法比较,建立了适宜工业化生产tPA的复性方法.
- 吴正辉郜金荣佘应龙叶力叶林柏
- 关键词：包涵体复性正交试验
- 毕赤酵母表达的HBV全长Pres蛋白的分离纯化被引量：2
- 2005年
- 巴斯德毕赤酵母工程菌株GS115PreS经发酵在甲醇诱导下可高效表达分泌型全长PreS蛋白。Westernblot证明发酵液中存在着可溶性的分子量为48kD的PreS蛋白和蛋白质颗粒,蛋白质颗粒主要成分为48kD的全长Pres蛋白和28kD的S蛋白,电镜观察发现蛋白质颗粒直径为30nm。发酵液经过脱盐、浓缩处理后,上清液经DEAESFF阴离子交换柱得到纯化的PreS蛋白;超速离心和蔗糖密度梯度离心得到蛋白颗粒。该颗粒的主要组分为全长PreS蛋白(PreS1+PreS2+S),还有少量的主蛋白(S)。ELISA检测证明全长PreS蛋白和蛋白颗粒有着良好的抗原性,PN显示蛋白颗粒的抗原性比PreS蛋白的抗原性高。
- 韩雪叶林柏李宝宗佘应龙叶力郑竑高博郜金荣吴正辉
- 关键词：发酵分离纯化免疫原性
- HBV X基因的表达及在真核细胞中对内质网压力的作用被引量：1
- 2006年
- 运用PCR技术获得HBx基因,分别克隆到原核表达载体pET-his和真核表达载体pcDNA3.1(-)上。重组质粒pET-his-HBx转化大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导表达,利用Ni柱纯化后的蛋白免疫家兔,获得特异性的抗-HBx兔抗血清。重组质粒pcDNA3.1(-)-HBx分别转染HepG2和Hep3B细胞系后,经RT-PCR和Westernblot检测,证明HBx可以在这两种细胞系中表达。通过报告基因的表达研究了HBx对XBP1和GRP78启动子的激活活性,结果表明瞬时转染HBx的细胞系中,XBP1和GRP78启动子介导的荧光素酶活性比相应的对照细胞增加了3～7倍。通过RT-PCR分析证明,转染了HBx的细胞中XBP1mRNA发生了剪切。因此,可以初步推断HBx在HepG2和Hep3B细胞中的表达可以引起内质网压力反应,为进一步阐明HBx表达对内质网的影响和肝脏病原发生机制奠定了基础。
- 高博李宝宗韩涛叶林柏王薇曾莹春孔令保郑竑韩雪吴正辉佘应龙叶力
- 关键词：乙型肝炎病毒HBX蛋白
- TT病毒ORF_2在Cos7细胞中的表达及蛋白质定位
- 2004年
- 应用PCR方法从含有TTVirusORF2的质粒pET-His-TTV2中扩增出606bp的蛋白质编码区,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1中以表达成GFP-VP2融合蛋白。构建出的重组质粒pEGFPTTV2经过酶切分析和PCR鉴定。用脂质体介导法将pEGFPTTV2质粒DNA转染Cos7细胞,通过RT-PCR分析,证实细胞中存在ORF2基因的转录产物。用共聚焦显微镜结合PI染色技术研究TTVVP2蛋白在细胞中的分布情况。结果表明,TTVVP2分布在细胞质中和细胞核膜内侧。因此推测VP2作为一种非结构蛋白,功能可能是参与病毒DNA的复制或转录。
- 何燕叶林柏李礼廖庆姣特马力佘应龙叶力吴正辉
- 关键词：GFPVP2蛋白质定位
- HCV NS5B蛋白对HCVRNA的模板特异性研究被引量：5
- 2005年
- 在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达并纯化HCV的依赖于RNA的RNA多聚酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRp,NS5B蛋白)。以HCV正、负链RNA3′末端的序列为模板,体外研究NS5B蛋白催化的RNA合成。结果显示,正链RNA在体外不能指导RNA合成,而负链RNA模板可以产生一条全长的正链RNA产物,表明NS5B对负链RNA具有模板特异性。NS5B对负链RNA的特异性在模板竞争性实验中得到进一步证实,正链RNA的存在和竞争对以负链为模板的RNA合成没有影响。这样,就合理解释了在HCVRNA复制时正链RNA的数量远比负链RNA多这一问题。同时,本实验的结果也为进一步研究病毒或其它细胞因子参与以正链RNA为模板进行的RNA合成,以及有关负链RNA模板特性的研究奠定了基础。
- 叶力叶林柏佘应龙Khalid Amine Timani廖庆姣吴正辉郜金荣孔令保李宝宗曾莹春
- 丙型肝炎病毒NS5A蛋白对Huh7细胞周期的影响
- 2005年
- 应用PCR技术从含有丙型肝炎病毒(HCV)全长开放阅读框的质粒pBRTM/HCV 1～3 011中获得NS5A全长基因片段,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中.通过酶切、PCR及测序鉴定证实,NS5A基因已正确插入到pcDNA3.1(-)中.再利用脂质体介导转染Huh7细胞,30h后收获细胞,经Western blot验证,证实HCV的NS5A基因在Huh7细胞中已经获得表达.在培养条件完全一致的条件下,表达NS5A基因的Huh7细胞与pcDNA3.1(-)转染的细胞在转染30h后被收集起来,乙醇固定,PI染色后利用流式细胞仪检测细胞周期变化.G0/G1期由60.6%下降到49.7%,S期由23.9%上升到32.7%,而转染pcDNA3.1(-)细胞的细胞周期与正常的Huh7细胞则差别不大.从而证明HCV NS5A蛋白对Huh7细胞周期具有调节作用.
- 杨小骏叶林柏郜金荣刘静郑义廖庆姣佘应龙吴正辉叶力
- 关键词：丙型肝炎病毒NS5A蛋白细胞周期
- 丙型肝炎病毒NS2蛋白在Huh-7细胞中抑制NF-κB活性
- 2004年
- 将丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS2基因的全长序列插入到真核表达载体pCDNA3.1(-)CMV启动子下游,构建成重组质粒pCNS2.用脂质体LipoVecTM转染Huh-7细胞,转染细胞内可检出NS2的mRNA和蛋白质,表明构建的pCNS2可在Huh-7细胞内成功表达;把不同剂量的pCNS2质粒DNA与报告质粒pNF-κ B-Luc共转染Huh-7细胞,48h后检测荧光素酶活性,结果显示与pCNS2共转染的细胞中pNF-κ B-Luc表达出的荧光素酶的活性比对照细胞降低了约2～4倍,并呈明显的剂量相关性.表明HCV NS2对NF-κ B激活转录活性有明显的抑制作用.这可能与HCV慢性持续性感染的致病性有一定的相关性.
- 阳帆叶林柏刘静杨小骏廖庆娇佘应龙叶力
- 关键词：丙型肝炎病毒真核表达载体
- HCV5A基因在Hela细胞中的稳定表达及对细胞生长的抑制现象被引量：2
- 2004年
- 应用PCR技术从含有HCV(HepatitisCvirus)全长开放阅读框的质粒pBRTM/HCV1-3011中获得NS5A全长基因片断,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中。通过酶切、PCR及测序鉴定NS5A基因已正确插入到pcDNA3.1(-)中,再利用脂质体介导转染Hela细胞,48h后传代并利用pcDNA3.1(-)质粒上的neo抗性基因加入G-418进行筛选。大约两周后,获得稳定表达的细胞株。经RT-PCR及westernblot验证,证实HCV的NS5A基因在Hela细胞中已经获得了表达。在培养条件完全一致的条件下,表达NS5A基因的Hela细胞与pcDNA3.1(-)转染的细胞相比,生长速度明显变慢,其倍增时间约为35-36h,比对照组细胞增加了约50%,而转染pcDNA3.1(-)的细胞的倍增时间与正常Hela细胞则无明显差别,都为23-24h。从而证明HCV的NS5A蛋白具有抑制Hela细胞生长的作用。
- 杨小骏叶林柏郜金荣刘静阳帆叶力佘应龙廖庆娇吴正辉郑义
- 关键词：丙型肝炎病毒HCVPCR技术HELA细胞细胞生长
