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密码子优化提高多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶异源表达量被引量：5: 2017年; 多粘类芽孢杆菌BN1株β-葡萄糖苷酶A的基因中含有很多大肠杆菌的稀有密码子,这限制了其在大肠杆菌中的表达。本研究选择部分稀有密码子同义替换为大肠杆菌的偏爱密码子,结果得到了表达量显著提高的基因型。经过对β-葡萄糖苷酶A基因各密码子使用频率的分析,选出2种密码子:大肠杆菌使用频率极低的密码子(Ⅰ型)、大肠杆菌使用频率一般但酶基因中频繁出现的密码子(Ⅱ型)。通过定点突变,这些密码子均被替换为宿主细胞使用频率最高的同义密码子。研究结果表明,I型单密码子替换可以使酶的表达量提高3~6倍,II型单密码子替换可以使酶的表达量提高3~4倍。最终,通过组合对提高该酶表达量贡献较大的突变,得到一个表达量提高13倍的基因型(WT-13)。本研究显著提高了β-葡萄糖苷酶A在大肠杆菌宿主中的异源表达水平,为酶的工业化应用奠定了基础。本研究将Escherichia coli BL21(DE3)本源表达的β-半乳糖苷酶选为内参蛋白质,提出相对表达量指数的概念,为同类酶在E.coli BL21(DE3)表达水平的表征提供了参考。; 陈荫楠刘震石贤爱王祖鑫; 关键词：Β-葡萄糖苷酶密码子偏性定点突变

枯草芽孢杆菌β-糖苷酶的克隆表达、体外定向进化及结构模拟被引量：1: 2015年; 【目的】从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出bgl C基因并在大肠杆菌中表达,分析表达产物的酶学性质并进行结构模拟,为进一步研究其生理功能及结构解析奠定基础。【方法】将bgl C基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,通过定向进化获取水解效率提高的突变株,经Ni-NTA镍离子层析柱纯化后,测定野生枯草芽孢杆菌β-糖苷酶与突变酶的性质。利用CD光谱,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及三维结构建模,分析野生酶与突变酶的高级结构。【结果】野生酶的比活力为9.7 U/mg,最适催化温度为60℃,最适p H值是7.0。经过突变和筛选,我们得到一个突变体BS-GLY_M1(A242T/T385A/S425L),其比活力达到17.1 U/mg,最适温度为55℃,最适p H值是7.0,在55℃下的半衰期为3.5 h,比野生酶增加2 h。突变酶对4-硝基苯基-β-半乳糖苷、乳糖和熊果苷的催化效率(Km/Kcat)有所提高。酶在天然条件下以二聚体、四聚体状态存在,推测它以二聚体为基本功能单位。结构模拟结果表明突变后酶的三维结构有轻微地变化,这可能是酶热稳定性和催化效率提高的原因。【结论】枯草芽孢杆菌β-糖苷酶可以在大肠杆菌中高效表达并可以通过定向进化提高其水解效率。; 刘震陈倩陈荫楠王祖鑫朱秋享石贤爱; 关键词：易错PCR 底物特异性 CD光谱寡聚体

β-葡萄糖苷酶体外分子改造研究进展被引量：6: 2015年; β-葡萄糖苷酶是纤维素酶的重要成分之一,负责纤维素的最终降解,在畜牧生产、食品行业、能源和医疗卫生等领域都有重要应用.天然来源的β-葡萄糖苷酶表达水平低、分离纯化困难,阻碍了β-葡萄糖苷酶的进一步应用.利用蛋白质工程技术对β-葡萄糖苷酶进行体外改造,提高其糖苷水解或者低聚糖苷合成活性,是β-葡萄糖苷酶研究及应用的趋势.就β-葡萄糖苷酶体外分子改造的研究进展及成果进行综述,比较不同分子改造策略的特点,总结β-葡萄糖苷酶分子改造过程中的一般规律,展望β-葡萄糖苷酶分子改造的研究及发展方向,为微生物来源的β-葡萄糖苷酶的体外分子改造研究提供参考.; 刘震朱秋享石贤爱彭永辉陈荫楠; 关键词：Β-葡萄糖苷酶定点突变定向进化

南日鲍β-葡萄糖苷酶分离纯化及表征被引量：6: 2014年; 采用硫酸铵分段盐析、透析、DEAE-纤维素离子交换层析和葡聚糖Sephadex G-100凝胶层析,从南日鲍内脏中分离纯化得到一种β-葡萄糖苷酶.SDS-PAGE分析表明,所纯化的β-葡萄糖苷酶为单聚体,分子量约为90 kDa,N-端8个氨基酸残基序列为AGMLYPRV.β-葡萄糖苷酶的最适温度为50℃,最适pH值为5.0,Mn2+、Cu2+、Ba2+和Zn2+对酶活力有显著的促进作用,而Al3+对酶有明显的抑制作用,SDS则使酶变性失活;pNPG与β-葡萄糖苷酶之间的亲和程度最高,纤维二糖和京尼平苷次之,水杨苷最差.; 石贤爱张利刘震王祖鑫匡文朱秋享; 关键词：内脏 Β-葡萄糖苷酶纯化酶学性质

核糖体展示技术筛选抗呋喃唑酮单链抗体: 2023年; 目的运用核糖体展示技术筛选高特异性抗呋喃唑酮(furazolidone,FZD)单链抗体,并进行初步分析。方法提取小鼠杂交瘤细胞总RNA,利用反转录PCR及重叠延伸(splicing by overlap extension,SOE)-PCR技术合成VH-linker-VL单链抗体文库。采用TNT T7 Quick for PCR DNA试剂盒对单链抗体文库进行体外翻译及筛选,经过三轮筛选富集目的基因,对目的基因进行原核表达及纯化后,初步分析其特异性及亲和力。结果获取1株特异性较高的单链抗体FZD-ScFv1,IC_(50)值为13.01 ng/mL,与呋喃它酮、呋喃妥因、氨基脲、呋喃西林及其衍生物之间的交叉反应率均小于1%。结论利用核糖体展示技术成功获得亲和力较好的单链抗体,该抗体可用于建立ELISA法,为FZD残留量的快速检测提供了新的思路。; 陈荫楠罗彩林郑晨娜石贤爱刘震; 关键词：呋喃唑酮单链抗体核糖体展示技术

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刘震

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